低氧暴露對小鼠脾淋巴細胞增殖和凋亡的影響

郭玉靜，胡英，龍啟福，許玉珍，李積東，永勝

氧關乎生物的生命，當機體處于低氧狀態時會引起組織和細胞不可逆轉的損傷。低氧會改變細胞代謝［1］，誘導炎性細胞因子產生［2］，導致氧化損傷［3］，并影響細胞的增殖和凋亡信號通路［4］。淋巴細胞作為機體重要的適應性免疫應答細胞，在維持免疫穩態中必不可少。研究發現，低氧暴露可抑制CD3/CD28抗體介導的T淋巴細胞增殖、分化并減少B淋巴細胞激活因子受體和表面受體（如BCR、CD19等），導致淋巴細胞水腫，未成熟B淋巴細胞發育停滯，T、B淋巴細胞數量減少，最終誘導淋巴細胞損傷［5-7］。本課題組前期研究發現，低氧暴露30 d后，小鼠脾的T淋巴細胞數量減少、CD4+T/CD8+T淋巴細胞比例下降且CD4+T淋巴細胞活化水平顯著降低［8］。然而，并未對低氧暴露誘導淋巴細胞數量減少的機制進行探究。因此，本研究通過檢測低氧暴露對淋巴細胞增殖和凋亡的影響，以探究低氧誘導下淋巴細胞數量減少的潛在機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物6～8周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠30只，體質量（18±2）g，購自西安交通大學醫學部實驗動物中心，動物生產許可證號：SYXK（陜）2020-005。飼養于18～22℃動物房中，自由進食飲水。本實驗已經過青海大學倫理協會審查。

1.2試劑和儀器胎牛血清（FBS，北京TransGen Biotech公司）；抗小鼠CD3藻紅蛋白-花青素7（PE-cy7）抗體、抗小鼠CD19別藻青蛋白（APC）抗體、羧基熒光素乙酰乙酸（CFSE）增殖檢測試劑盒、FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；淋巴細胞非特異性刺激物刀豆蛋白A（ConA，美國Sigma公司）；逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（日本TaKaRa公司）；引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］；硝酸纖維素（NC）膜（美國Pall Corporation公司）；鼠源B細胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）蛋白抗體、鼠源胱天蛋白酶-3（caspase-3）蛋白抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗（Proteintech公司）；兔源bcl-2同源拮抗劑-殺傷蛋白（Bak）蛋白抗體（Affinity公司）；增強化學發光液（美國Thermo Fisher Scientific公司）。細胞培養箱（中國海爾公司）；低氧培養箱（美國BioSpherix公司）；流式細胞儀（美國Beckman公司）；冷場發射掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司）；熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統（法國VILBER公司）。

1.3方法

1.3.1小鼠脾淋巴細胞分離和培養將小鼠脫頸處死，用75%乙醇浸泡5 min，然后用無菌鑷剪切開小鼠腹腔，摘除脾，用1 mL PBS清洗5次。將脾切為3份，置于2 mL PBS的無菌平皿內，用無菌鑷擠壓脾組織。取脾細胞懸浮液經200目尼龍篩濾器后，于50 mL無菌離心管中，4℃、1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加3 mL紅細胞裂解液混合均勻，置于冰盒15 min，充分溶解后4℃、1 500 r/min離心10 min，棄去上清液，PBS沖洗1～2次。最后將含10%FBS與1%的青鏈霉素的RPMI 1640培養液重懸浮細胞。用細胞計數儀對10 μL的細胞進行計數，重復3次，取平均值（細胞存活率≥95%）。將細胞濃度調整為2.0×106/mL，然后將細胞（1×106個/mL）加入24孔板。將同一只小鼠淋巴細胞分為2組，常氧組置于CO2細胞培養箱（37℃、5%CO2、21%O2、74%N2），低氧組置于低氧培養箱（37℃、5%CO2、1%O2、94%N2）培養12、24、48 h。

1.3.2流式細胞術檢測T、B淋巴細胞數量離心收集細胞沉淀，加入100 μL PBS重懸細胞，再加入2 μL抗小鼠CD3PE-cy7和CD19 APC抗體，同時設空白組、CD3 PE-cy7單標管和CD19 APC單標管。避光孵育15 min后，加入400 μL PBS重懸細胞。將染色完畢的細胞懸液轉移至流式管，上機檢測T、B淋巴細胞百分比。

1.3.3CFSE檢測淋巴細胞增殖情況小鼠淋巴細胞提取完成后，加入CFSE（終濃度5 μmol/L）。37℃水浴15 min后，加入9×原體積的PBS，4℃、1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入10 mL含10% FBS的RPMI 1640培養液，4℃、1 500 r/min離心10 min，洗滌2次。調整細胞含量為2.0×106個/mL，置于24孔板中，每孔加ConA（終質量濃度3 mg/L）培養12、24、48 h，流式細胞術檢測淋巴細胞增殖率。

1.3.4Annexin V-FITC/PI雙染檢測淋巴細胞凋亡率通過FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒檢測凋亡百分比。用PBS洗滌細胞，4℃、1 500 r/min離心5 min，棄上清液，再懸浮在100 μL的1×FITC Binding Buffer中。用5 μL FITC Annexin V和5 μL PI避 光 染 色15 min。然 后 加 入400 μL 1×FITC Binding Buffer，培養12、24、48 h，流式細胞術檢測淋巴細胞凋亡率。

1.3.5掃描電鏡（SEM）觀察淋巴細胞形態離心收集細胞，加入2.5%戊二醛，并在4℃下固定24 h，隨后用PBS清洗3次。將樣品分別在30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇中梯度脫水10 min，干燥至臨界點。樣品在雙面導電膠帶上鋪展，粘貼在金屬短柱上，在濺射鍍膜裝置中鍍金2 min，然后在掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3.6qPCR檢測Bak、bcl-2、caspase-3的mRNA表達離心收集細胞沉淀，加入1 mL TRIzol提取細胞總RNA，進行RNA濃度及純度測定，并將RNA逆轉錄為cDNA。以β-actin為內參，用qPCR法檢測淋巴細胞Bak、bcl-2、caspase-3的mRNA表達量。qPCR反應體系：2×SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，上、下游引物（均為10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應條件：95℃預變性30 s；95℃5 s，63℃60 s，循環50次。采用2－ΔΔCt法計算相關基因mRNA相對表達量。引物序列見表1。

Tab.1 Sequence of the primers in qPCR表1 qPCR引物序列

1.3.7Western blot檢測Bak、bcl-2、caspase-3蛋白表達離心收集細胞，加入40～60 μL蛋白裂解液提取總蛋白，并用BCA法檢測其濃度，調整蛋白上樣量為30 μg/孔。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行蛋白質分離，隨后將其轉移到NC膜上。在室溫下5%的脫脂奶粉中封閉2 h，TBST清洗3遍，添加Bak（1∶300）、bcl-2（1∶500）、caspase-3（1∶500）、β-actin（1∶10 000）一抗，在4℃下孵育過夜。次日，TBST清洗膜，用二抗（1∶5 000）在室溫下孵育1 h。最后使用增強化學發光（ECL）顯色液對蛋白進行可視化，并用Image J分析軟件進行分析。

1.4統計學方法采用SPSS 18.0軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 低氧處理對T、B淋巴細胞數量的影響 與常氧組比較，低氧組12、24、48 h時T、B淋巴細胞的百分比下降（P＜0.05）。見表2。

2.2 低氧處理對小鼠淋巴細胞增殖的影響 與常氧組比較，12、24、48 h時低氧組淋巴細胞增殖率顯著下降（P＜0.01）。見圖1、表3。

2.3 低氧處理對淋巴細胞凋亡的影響 與常氧組比較，12、24、48 h低氧組淋巴細胞凋亡率均顯著增加（P＜0.05），見表4、圖2。

2.4 低氧處理對淋巴細胞形態的影響同一時間下低氧組較常氧組更早出現淋巴細胞凋亡形態學特征，見圖3。12 h時，常氧組淋巴細胞形態正常，細胞膜完整，表面可見微絨毛；而低氧組淋巴細胞表面微絨毛消失。24 h時，低氧組較常氧組淋巴細胞體積增大，細胞破碎，胞漿外溢。48 h時，大量細胞出現晚期凋亡特征，常氧組淋巴細胞體積開始增大，細胞塌陷、胞漿外溢，呈火山口樣結構；低氧組淋巴細胞見大小不等、呈杵狀和球狀的突起，細胞完全破碎。

2.5 低 氧 對 淋 巴 細 胞Bak、bcl-2、caspase-3的mRNA表達影響與常氧組相比，12、24、48 h時，低氧組淋巴細胞Bak和caspase-3的mRNA表達量上調，bcl-2的mRNA表達量下調（P＜0.01），見表5。

2.6 低氧對淋巴細胞Bak、bcl-2、caspase-3的蛋白表達影響12、24、48 h時，低氧組較常氧組淋巴細胞Bak和caspase-3蛋白表達量升高，bcl-2蛋白表達量降低（P＜0.05）。見表6、圖4。

Tab.2 Comparison of the percentages of T and B lymphocytes at different time points between the two groups表2 2組不同時間T、B淋巴細胞百分比比較 （n=3，%，±s）

Tab.2 Comparison of the percentages of T and B lymphocytes at different time points between the two groups表2 2組不同時間T、B淋巴細胞百分比比較 （n=3，%，±s）

＊P＜0.05。

組別常氧組低氧組t 12 h T淋巴細胞40.17±1.90 32.26±3.30 3.603＊B淋巴細胞33.47±2.38 27.42±2.73 2.895＊24 h T淋巴細胞32.65±4.60 23.77±2.61 2.904＊B淋巴細胞27.96±1.50 23.39±2.31 2.873＊48 h T淋巴細胞26.30±1.11 23.16±1.33 3.140＊B淋巴細胞24.62±2.88 18.71±1.31 3.229＊

Fig.1 Effects of normoxia and hypoxia exposure on lymphocyte proliferation at different time points圖1常氧和低氧暴露不同時間對淋巴細胞增殖的影響

Tab.3 Comparison of lymphocyte proliferation rates at different time points between two groups表3 2組不同時間淋巴細胞增殖率比較（n=3，%，±s）

Tab.3 Comparison of lymphocyte proliferation rates at different time points between two groups表3 2組不同時間淋巴細胞增殖率比較（n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01。

組別常氧組低氧組t 12 h 31.56±1.63 27.31±2.05 4.749＊＊24 h 38.50±0.31 34.74±0.82 11.324＊＊48 h 43.32±1.35 40.66±0.49 5.566＊＊

Tab.4 Comparison of apoptosis rate of lymphocyte at different time points between the two groups表4 2組不同時間淋巴細胞凋亡率比較（n=3，%，±s）

Tab.4 Comparison of apoptosis rate of lymphocyte at different time points between the two groups表4 2組不同時間淋巴細胞凋亡率比較（n=3，%，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別常氧組低氧組t 12 h 17.05±1.33 22.28±1.13 5.446＊＊24 h 30.66±3.11 36.34±1.64 3.172＊48 h 82.01±1.66 86.99±1.42 6.033＊＊

Fig.2 Effects of normoxia and hypoxia exposure on lymphocyte apoptosis at different time points圖2常氧和低氧暴露不同時間對淋巴細胞凋亡的影響

Fig.3 Lymphocyte morphological changes of hypoxia exposure at different time points observed by SEM圖3 SEM觀察低氧暴露不同時間淋巴細胞形態變化

3 討論

低氧與免疫功能障礙關系密切。脾作為體內最大的免疫器官在維持免疫穩態中發揮重要作用。脾的淋巴細胞是產生免疫應答的主要部分，其數量變化與機體免疫功能密切相關［9］。因此，在本研究中選擇脾淋巴細胞作為研究對象來判斷低氧暴露后小鼠的免疫狀態。

CD3+分子在所有成熟T淋巴細胞中表達，是T淋巴細胞表面的特異性標志物。CD19+是B淋巴細胞表面的特異性標志物。本研究通過PE-cy7 CD3+和APC CD19+熒光染料分別標記T、B淋巴細胞，發現低氧暴露下T、B淋巴細胞數量均減少。在低氧條件下，缺氧誘導因子（HIF）表達常升高。研究發現，HIF-1α可以促進滑膜成纖維細胞與B淋巴細胞之間相互作用，抑制調節性B淋巴細胞和初始B淋巴細胞生長，并誘導γ干擾素（IFN-γ）、白細胞介素（IL）-17炎性細胞因子和IgG自身抗體的產生，從而加重類風濕性關節炎患者的病情［10］。研究表明［11-12］，低氧可抑制CD4+、CD8+T淋巴細胞的增殖，并降低活化T細胞總腺苷三磷酸產量以及IFN-γ、IL-3、IL-12和IL-18分泌。CD4+T淋巴細胞主要分化為Th細胞，Th細胞在免疫應答過程中起關鍵作用，影響免疫細胞的活化［13-14］。Th細胞活化后分化為Th1、Th2和Tfh效應細胞，其中Th2亞群通過分泌IL-4、IL-5、IL-6等細胞因子，Tfh細胞通過分泌IL-21促進B淋巴細胞的增殖和分化［15］。因此，推斷低氧暴露下T淋巴細胞數量的減少可能影響調節B淋巴細胞生長的細胞因子分泌，進而導致B淋巴細胞減少。

Tab.5 Comparison of mRNA expression levels of Bak,bcl-2 and caspase-3 in lymphocytes at different time points between the two groups表5 2組低氧暴露不同時間淋巴細胞Bak、bcl-2、caspase-3 mRNA表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.5 Comparison of mRNA expression levels of Bak,bcl-2 and caspase-3 in lymphocytes at different time points between the two groups表5 2組低氧暴露不同時間淋巴細胞Bak、bcl-2、caspase-3 mRNA表達水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別常氧組低氧組t 12 h Bak 0.98±0.12 1.11±0.18 2.248＊bcl-2 1.00±0.10 0.66±0.21 4.527＊＊caspase-3 0.96±0.08 1.25±0.35 2.171＊24 h Bak 1.01±0.36 1.43±0.28 2.724＊bcl-2 1.10±0.30 0.52±0.22 4.440＊＊caspase-3 0.94±0.08 1.15±0.19 2.532＊48 h Bak 0.95±0.49 1.44±0.42 2.721＊bcl-2 1.16±0.47 0.74±0.39 2.516＊caspase-3 0.98±0.16 2.21±0.56 5.973＊＊

Tab.6 Comparison of Bak,bcl-2 and caspase-3 protein expression levels in lymphocytes at different time pointsbetween the two groups of mice表6 2組低氧暴露不同時間淋巴細胞Bak、bcl-2、caspase-3蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.6 Comparison of Bak,bcl-2 and caspase-3 protein expression levels in lymphocytes at different time pointsbetween the two groups of mice表6 2組低氧暴露不同時間淋巴細胞Bak、bcl-2、caspase-3蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別常氧組低氧組t 12 h Bak 0.31±0.11 0.54±0.09 2.828＊bcl-2 0.62±0.06 0.44±0.09 2.819＊caspase-3 0.45±0.08 0.72±0.15 2.794＊24 h Bak 0.23±0.15 0.48±0.03 2.799＊bcl-2 0.90±0.14 0.50±0.17 3.117＊caspase-3 0.71±0.06 0.94±0.13 2.787＊48 h Bak 0.37±0.13 0.73±0.17 2.867＊bcl-2 0.36±0.04 0.23±0.02 4.658＊＊caspase-3 0.36±0.03 0.66±0.10 4.950＊＊

Fig.4 Protein expression levels of Bak,bcl-2 and caspase-3 in lymphocytes at different time points between the two groups of mice圖4低氧暴露不同時間淋巴細胞Bak、bcl-2、caspase-3的蛋白表達水平

淋巴細胞增殖和凋亡可影響CD4+T/CD8+T淋巴細胞的比例［8］、T淋巴細胞和B淋巴細胞的數量及免疫系統功能［16-17］。為進一步探究低氧暴露下淋巴細胞數量減少的原因，本研究通過流式細胞術檢測低氧暴露對淋巴細胞增殖和凋亡的影響，發現在ConA刺激下，低氧暴露對淋巴細胞增殖有抑制作用。淋巴細胞增殖是免疫應答的重要因素，增殖減少可導致細胞損傷修復、細胞周期調節和染色體重組等功能發生改變［18-19］。此外，細胞凋亡也是引起細胞損傷的重要因素，低氧在促進淋巴細胞凋亡中起關鍵作用。研究發現，HIF通過抑制過渡性B細胞，來增加生發中心B淋巴細胞的糖酵解速率，從而減少細胞增殖、促進凋亡并調節抗體產生［20］。Shan等［21］將HIF-1α轉染至巨噬細胞后與淋巴細胞共培養，可以抑制T淋巴細胞增殖，促進細胞凋亡。本研究通過評估淋巴細胞凋亡率，發現低氧能明顯誘導淋巴細胞凋亡，提示淋巴細胞增殖減少或凋亡增加可能是低氧暴露誘導T、B淋巴細胞減少的重要原因。

為進一步明確低氧引起淋巴細胞數量改變的主要原因，本研究通過SEM觀察淋巴細胞形態。結果顯示，淋巴細胞隨著時間的推移出現凋亡特征形態學改變，且在同一時間下低氧組較常氧組更早出現凋亡特征形態學變化，提示低氧可能主要通過誘導淋巴細胞凋亡而使其數量減少。細胞凋亡由多個基因和通路協調。bcl-2家族在細胞凋亡中起至關重要的作用，主要分布在核膜、線粒體膜和內質網膜上，以維持細胞器膜的完整性［22］。bcl-2家族主要分為抗凋亡基因（bcl-2、bcl-xl等）和促凋亡基因（Bax、Bak等）［23］。這2組蛋白表達失衡可導致線粒體損傷，釋放促凋亡因子并激活下游caspases家族，引起細胞凋亡［24］。caspase-3的激活通常被認為是細胞凋亡進入不可逆階段的標志［25］。研究發現，低氧通過下調bcl-2誘導心肌細胞凋亡［26］。Zhao等［27］發現，低氧暴露促進人類子宮囊性韌帶成纖維細胞凋亡，凋亡相關因子caspases、Bax/bcl-2顯著上調。本研究中低氧暴露不同時間下淋巴細胞抗凋亡基因bcl-2的mRNA和蛋白表達量顯著下調；促凋亡基因Bak和caspase-3的mRNA和蛋白表達量顯著上調，與上述研究結果一致。

綜上，低氧暴露可降低小鼠脾T淋巴細胞和B淋巴細胞數量，抑制淋巴細胞增殖，促進淋巴細胞凋亡，并進一步加快淋巴細胞出現凋亡特征形態學改變，同時誘導凋亡相關因子在轉錄和蛋白水平發生顯著差異。后續將進一步探討低氧暴露誘導淋巴細胞凋亡的具體機制及相關通路，為揭示低氧引起免疫功能障礙的機制提供新的實驗依據。