高糖通過miR-192調控CAV-1/EGF影響腎小球系膜細胞增殖、遷移及細胞外基質形成的機制研究

吳瑋熙，劉帥輝，周賽君，劉紅巖，張睿，于珮

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病較嚴重的并發癥之一［1-2］。目前，控制血糖、血壓或阻斷腎素血管緊張素系統（renin angiotensin system，RAS）等傳統治療方法可以延緩DKD的進展，但尚無有效的方法預防或逆轉DKD向腎功能衰竭進展［3］。因此，深入探討DKD的發病機制，挖掘DKD治療的新靶點，為臨床預防和治療DKD提供新的思路顯得十分重要和緊迫。DKD早期的主要病理特征是腎小球肥大，逐漸導致腎小球細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積和腎小管間質纖維化，最終發展為腎臟不可逆的結構損傷［4］。研究表明，微小RNA（microRNA，miR）-192在腎小球系膜細胞外基質增生及系膜細胞肥大等方面發揮重要作用，抑制miR-192的表達可以改善DKD的腎臟纖維化［5］，但具體機制尚不明確。本課題組前期通過尿蛋白組學篩選并驗證了表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）可作為DKD早期標志物，并檢索miRNA數據庫發現小窩蛋白1（caveolin 1，CAV-1）可能是miR-192的靶蛋白，但確切調控機制有待進一步探索［6］。本研究旨在探討miR-192在高糖誘導的人腎小球系膜細胞損傷的作用及相關機制，及其可否通過調節CAV-1和EGF表達參與DKD的進展，為研究DKD發生、發展提供新的思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養基、Opti-MEM培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；miR-192inhibitor/micmics、DEPC水購自中國上海吉瑪制藥技術有限公司，實時熒光定量PCR（qPCR）引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑購自北京Solarbio科技有限公司；小鼠抗人CAV-1、EGF、1型膠原蛋白（COLⅠ）、纖連蛋白（FN）、β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標記的兔抗小鼠IgG購自Protein Tech公司；NC膜購自美國Pall Corporation公司；ECL超敏化學發光液購自美國Advansta公司；預染蛋白Marker、Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scienfic公司；Takara RNAiso Plus、SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseHPlus）購自日本寶生物工程有限公司；CCK-8試劑盒購自中國MCE有限公司；Western blot系統、凝膠成像分析系統和細胞培養箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司；倒置熒光顯微鏡購自Olympus公司；酶標儀購自Bio-Rad公司。

1.2細胞培養人腎小球系膜細胞系（HMCs）購自北京北納創聯生物技術院，用含有10%FBS的RPMI 1640培養基在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。根據細胞生長狀況，每1～2 d換1次液，待細胞處于對數生長期進行后續實驗。

1.3細胞轉染及分組細胞按照隨機數字表法分為6組：正糖組（NG組，5.6 mmol/L葡萄糖）、高糖組（HG組，25 mmol/L葡萄糖）、NG+mimics組（5.6 mmol/L葡萄糖+miR-192模擬物）、HG+mimics組（25 mmol/L葡萄糖+miR-192模擬物）、NG+inhibitor組（5.6 mmol/L葡萄糖+miR-192抑制劑）、HG+inhibitor組（25 mmol/L葡萄糖+miR-192抑制劑）。HMCs接種于6孔板上，細胞匯合至80%～90%時，按照Lipofectamine 2000操作說明書將miR-192抑制劑和模擬物分別轉入生長狀態良好的腎小球系膜細胞中。轉染6 h后，根據不同條件更換液體培養24 h，用于后續實驗。

1.4CCK-8法檢測細胞增殖活性將細胞按照5×103/mL的密度接種在96孔板中，每組設置5個復孔，每孔加入100 μL培養基，放入細胞培養箱中培養過夜。待細胞貼壁后用不同培養基干預細胞24 h，然后向每孔中加入10 μL的CCK-8工作液后再放回培養箱中孵育0.5～4 h，每隔0.5 h用酶標儀測定450 nm處的光密度值（OD值），評估細胞活力。根據OD值計算細胞增殖率，增殖率=［（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）］×100%。

1.5劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力將細胞按1×105/孔接種于6孔板中，37℃恒溫培養過夜，用200 μL的高壓滅菌槍頭垂直沿著無菌直尺劃痕，盡量保證使劃痕寬度一致。用磷酸鹽緩沖液沖洗掉細胞劃痕產生的碎屑，加入2 mL無血清培養基后放入細胞培養箱中繼續培養，分別于0 h、24 h時拍照記錄結果。用Image J軟件計算劃痕面積（S），并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=［1-（S24h/S0h）］×100%。

1.6qPCR檢測miR-192、EGF、CAV-1、FN、COLⅠmRNA表達利用Trizol法提取細胞總RNA，測量RNA濃度和純度，利用試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA。PCR引物設計見表1。取1 μL的cDNA產物進行qPCR擴增。擴增條件：預變性95℃30 s；95℃5 s，55℃30 s，72℃30 s，45個循環；溶解曲線分析：95℃5 s，65℃60 s，95℃1 s，采用2-ΔΔCt法計算各個指標相對表達量。

1.7Western blot檢測蛋白表達將干預后的細胞收集到2 mL離心管中，離心后用PBS重懸細胞清洗3遍，加入RIPA裂解液和廣譜蛋白酶抑制劑，充分裂解后吸取到1.5 mL離心管中。4℃、12 000×g離心10 min取上清液，加入上樣緩沖液，沸水浴10 min。取10 μL蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，經轉膜儀轉膜后加入5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗滌后分別加入CAV-1、EGF、COLⅠ、FN一抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。TBST再次洗滌10 min×3次后加入二抗（1∶4 000）常溫孵育1 h，TBST洗滌后利用電化學（ECL）發光法顯色，掃描儀檢測結果。Image J軟件分析蛋白的灰度值，以β-actin為內參，計算蛋白相對表達量。

1.8統計學方法采用SPSS 26.0軟件分析數據，用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

Tab.1 The primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

2 結果

2.1 各組細胞增殖的情況與NG組相比，HG組和NG+mimics組細胞增殖率升高，NG+inhibitor組細胞增殖率下降（P＜0.05）。與HG組相比，HG+mimics組細胞增殖率增加，HG+inhibitor組細胞增殖率下降（P＜0.05）。與NG+inhibitor組相比，HG+inhibitor組細胞增殖率下降更明顯（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Comparison of proliferative activity of mesangial cells between the six groups圖1各組人腎小球系膜細胞的增殖活性比較

2.2 各組細胞遷移能力比較與NG組相比，HG組、NG+mimics組細胞劃痕愈合率增加（P＜0.05）；NG+inhibitor組劃痕愈合率降低（P＜0.05）；與HG組相比，HG+mimics組劃痕愈合率增加（P＜0.05），HG+inhibitor組 劃 痕 愈 合 率 降 低（P＜0.05），見圖2、3。

2.3 各組miR-192及CAV-1、EGF、FN、COLⅠmRNA相對表達水平比較與NG組相比，HG組和NG+mimics組miR-192、EGF、FN、COLⅠmRNA表達上調，CAV-1 mRNA表達下調（均P＜0.05）；NG+inhibitor組miR-192、EGF、FN、COLⅠmRNA表達下調，CAV-1 mRNA表達上調（P＜0.05）。與HG組相比，HG+mimics組miR-192、EGF、FN、COLⅠmRNA表達上調，CAV-1 mRNA表達下調（P＜0.05）；HG+inhibitor組miR-192、EGF、FN、COLⅠmRNA表達下調，CAV-1 mRNA表達上調（P＜0.05），見表2。

2.4 各組CAV-1、EGF、FN、COLⅠ蛋白相對表達水平與NG組相比，HG組CAV-1表達降低，EGF、FN和COLⅠ表達升高（均P＜0.05）。在NG組和HG組加入miR-192 mimics后，CAV-1表達降低，EGF、FN和COLⅠ表達升高（均P＜0.05）。在NG組和HG組分別加入miR-192 inhibitor后，CAV-1蛋白表達升高，EGF、FN和COLⅠ表達水平均降低，HG組加入miR-192 inhibitor趨勢更加明顯（均P＜0.05），見圖2、表3。

Fig.2 Migration ability of cells of the six groups(×200)圖2各組細胞的遷移能力（×200）

圖3 Comparison of the migration ability of cells between the six groups圖3各組細胞的遷移能力比較

Tab.2 Comparison of miR-192,CAV-1,EGF,FN,COLI mRNA levels of cells between the six groups表2各組細胞miR-192及CAV-1、EGF、FN、COLI mRNA水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of miR-192,CAV-1,EGF,FN,COLI mRNA levels of cells between the six groups表2各組細胞miR-192及CAV-1、EGF、FN、COLI mRNA水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與NG組比較，b與HG組比較，c與NG+mimics組比較，d與NG+inhibitor組比較，P＜0.05。

組別NG組HG組NG+mimics組HG+mimics組NG+inhibitor組HG+inhibitor組F miR-192 1.01±0.03 1.45±0.01a 1.23±0.01a 1.56±0.01bc 0.21±0.01a 0.18±0.02bd 2 943.628＊＊CAV-1 1.07±0.06 0.83±0.01a 0.51±0.01a 0.48±0.01bc 1.43±0.01a 1.66±0.01bd 1 001.858＊＊組別NG組HG組NG+mimics組HG+mimics組NG+inhibitor組HG+inhibitor組F EGF 1.01±0.03 1.53±0.01a 1.37±0.01a 1.62±0.00bc 0.74±0.01a 0.61±0.04bd 1 302.088＊＊FN 1.01±0.03 1.49±0.06a 1.52±0.03a 1.65±0.02bc 0.72±0.02a 0.68±0.01bd 1 244.431＊＊COLⅠ1.00±0.03 1.63±0.02a 1.52±0.01a 1.72±0.08bc 0.62±0.02a 0.57±0.01bd 619.000＊＊

Fig.2 Changes of CAV-1,EGF,FN and COLⅠprotein detected by Western blot assay圖2 Western blot法檢測CAV-1、EGF、FN、COLⅠ蛋白變化

Tab.3 Comparison of the protein levels of CAV-1,EGF,FN and COLI between the six groups表3各組細胞CAV-1、EGF、FN、COLI蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of the protein levels of CAV-1,EGF,FN and COLI between the six groups表3各組細胞CAV-1、EGF、FN、COLI蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與NG組比較，b與HG組比較，c與NG+mimics組比較，d與NG+inhibitor組比較，P＜0.05。

組別NG組HG組NG+mimics組HG+mimics組NG+inhibitor組HG+inhibitor組F CAV-1 0.95±0.01 0.93±0.01a 0.80±0.01a 0.55±0.01bc 1.06±0.01a 1.20±0.01bd 1 740.498＊＊EGF 0.71±0.02 0.78±0.11a 0.88±0.11a 0.88±0.11b 0.66±0.02a 0.48±0.01bd 509.618＊＊FN 0.67±0.01 0.95±0.02a 0.73±0.05a 1.07±0.11bc 0.58±0.02a 0.41±0.01bd 68.769＊＊COLⅠ0.81±0.01 0.84±0.01a 0.93±0.01a 1.08±0.08bc 0.78±0.08a 0.54±0.01bd 76.459＊＊

3 討論

DKD的主要病理特征包括腎小球基底膜增厚、系膜擴張和肥大以及ECM異常積累。FN和COLⅠ通常被認為是ECM的主要成分［7］，它們隨著間質ECM的積累增加，可明顯促進腎臟組織纖維化。研究表明，糖尿病患者的腎臟細胞可以調控ECM蛋白質如COLⅠ的表達，長期慢性高血糖刺激腎小球系膜細胞增殖，促使系膜細胞分泌細胞外基質增多，是導致腎小球硬化、腎小管間質纖維化和蛋白尿產生的重要病理機制［8］。COLⅠ是一種基膜膠原，是腎小球ECM的主要成分，在系膜細胞間相互交叉形成網絡［9］。FN是一種大分子糖蛋白，在細胞外基質中相互交叉形成網狀結構，為其他細胞外基質成分沉積提供支架［10］。在高糖刺激下ECM異常累積，系膜細胞增殖且隨著病情加重，這種趨勢更加顯著。本研究發現，和正常條件下培養的細胞比，高糖條件下培養的腎小球系膜細胞的增殖率和遷移愈合率均出現升高，ECM生成增多。利用miR-192 mimics或inhibitor處理系膜細胞，當miR-192表達增多或減少時，細胞增殖、遷移和ECM表現出相同的趨勢，說明miR-192參與了DKD的發生發展。

miR-192屬于microRNA家族中目前研究較為廣泛的一員，其可以影響細胞的分化以及增殖代謝，直接或間接地參與多種疾病發生發展［11-13］，包括DKD。有研究表明，miR-192在糖尿病患者腎臟中高度且完全特異表達，但其具體功能或靶標尚不完全清楚［14］。在慢性腎臟病小鼠模型中，高表達的miR-192可能作為保護因素發揮抗纖維化的作用，上調miR-192的表達可以通過Smad同源物3（Smad3）延緩腎間質纖維化［15］。與該結果相反的是，在DKD模型的小鼠的腎小球系膜細胞中，轉化生長因子β（TGF-β）通過miR-192誘導Smad相互作用蛋白1（SIP1）下調，減少E盒抑制因子1（EF1）對2型膠原（COLⅠA2）的抑制作用，增加COLⅠA2的表達，促進ECM增生，最終導致腎臟纖維化［16］。本研究發現，與正常葡萄糖濃度培養基培養的細胞比，高糖干預后的系膜細胞miR-192的表達水平增高，并通過靶向CAV-1，進一步引起系膜細胞增殖、遷移和ECM累積，促進DKD的進展。

CAV-1是形成富含膽固醇的膜微區小窩所需的完整膜蛋白，它是細胞黏附和遷移的重要調節劑，參與多種疾病的發生、發展［17］，對DKD的信號轉導很重要。過表達CAV-1能夠通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，減少系膜細胞的增殖［18］。有研究發現，乳腺癌細胞中，miR-192通過靶向CAV-1抑制腫瘤細胞增殖并誘導凋亡［19］。本研究發現，和正常糖濃度培養的腎小球系膜細胞對比，高糖培養的細胞miR-192表達增高，CAV-1的mRNA和蛋白表達水平均降低；用miR-192 inhibitor轉染系膜細胞下調miR-192的表達后，CAV-1的表達水平升高，而在轉染miR-192 mimics后發現，隨著系膜細胞miR-192表達水平的增高，CAV-1表達水平降低，說明miR-192抑制CAV-1的表達。

EGF是由十二指腸、腎臟等器官分泌的多肽［20-21］，參與增殖、代謝、分化等多種生物過程的調控，具有促進上皮細胞增殖分化作用，能促進包括腎小球系膜細胞和上皮細胞的增殖分化，與DKD早期腎小球肥大和腎小管硬化有關［22］。本課題組前期通過STRING分析發現EGF與CAV-1具有相互作用［12］。Orlichenko等［23］發現CAV-1能夠通過促進EGF的生成調節黏附結合蛋白（E-cadherin），增加胰腺腫瘤細胞的轉移和侵襲能力。本研究發現，經過高糖培養和轉染miR-192 micmics的腎小球系膜細胞，CAV-1表達水平降低，EGF表達水平升高，細胞增殖率升高；而在下調miR-192導致CAV-1過表達后，EGF表達水平受到抑制，提示在系膜細胞中，CAV-1可以抑制EGF表達。

綜上所述，高糖上調腎小球系膜細胞內miR-192表達，進而抑制CAV-1的表達，從而減弱CAV-1對下游蛋白EGF的負向調控作用，進而引起系膜細胞增殖和遷移，ECM生成增多，這一調控機制可能是DKD進展的關鍵因素之一。通過抑制miR-192的表達延緩腎小球系膜細胞增殖和遷移以及ECM的形成，可為防治和DKD提供新的靶點，也為DKD發病機制的初步探索提供了新的視角。