基于HPTT軸探討補脾強力復方調節EAMG大鼠免疫系統平衡的機制

王強，況時祥，李若照，婁金波，錢憶家，雍波，劉運權

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是由于乙酰膽堿受體抗體（acetylcholine receptor antibody，AchR-Ab）破壞神經肌肉突觸后膜乙酰膽堿受體而誘發的自身免疫性疾病，臨床主要表現為患者四肢近端無力、眼瞼下垂、復視和吞咽障礙等癥狀［1-2］。MG病情反復，遷延難愈，多合并甲狀腺功能異常等其他自身免疫性疾病，嚴重者可危及生命。目前臨床治療主要采用大劑量腎上腺皮質激素，但不良反應較大［3］。MG屬中醫“痿證”范疇，基本病機為臟腑肌肉筋脈損傷。該病起于脾虛，累及于腎，兼有水濕濁毒內生，治療上應予補脾益腎為主，化濕解毒貫穿始終。補脾強力復方以補中益氣湯為基礎方，結合臨床經驗辨證選藥，旨在脾腎雙補，化瘀祛濕，改善MG癥 狀［4］。下 丘 腦-垂 體-甲 狀 腺-胸 腺（hypothalamus-pituitary-thyroid-thymus，HPTT）軸是神經內分泌系統3個主要軸之一，是MG調節的主要傳出通路［5-6］。從HPTT軸調控胸腺自身免疫層面來揭示MG發病機制可能是治療MG的突破口［7］。本研究擬通過建立實驗性自身免疫性重癥肌無力（experimental autoimmune myasthenis gravis，EAMG）大鼠模型，探討補脾強力復方通過HPTT軸調節EAMG大鼠免疫系統的機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料實驗動物：清潔級Lewis雌性大鼠120只，9～10周齡，體質量180～200 g，購自吉林大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SYXK（吉）2021-0006。主要試劑：補脾強力復方（中藥配方顆粒，黃芪6 g，黨參6 g，蒼術2.2 g，土茯苓4 g，陳皮2 g，升麻2.2 g，丹參3.6 g，淫羊藿1.5 g，鎖陽2.2 g，生地4 g，制附片3.5 g）由廣東一方制藥有限公司生產，貴州中醫藥大學第二附屬醫院藥房提供；醋酸潑尼松片購自辰欣藥業股份有限公司（國藥準字H37021900，規格：5 mg）；注射用異戊巴比妥鈉購自上海上藥新亞藥業有限公司（國藥準字H31021725，規格：0.1 g），鼠源性AchR-sα亞基97-116肽段序列（R97-116）由西安美聯生物技術有限公司合成；CD4、CD25、Foxp3流式抗體購自英國Abcam；蘇木素（H9627）、水溶性伊紅Y（71014544）購自美國Sigma，大鼠AchR-Ab酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自FineTest；血清三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、促甲狀腺激素（TSH）、促甲狀腺激素釋放激素（TRH）、腫瘤壞死因子（TNF）-β、白細胞介素（IL）-4和IL-10檢測試劑盒購自北京北方生物技術研究所。主要儀器：RM 2016輪轉式切片機購自德國Leica公司、BX53型生物顯微鏡購自奧林巴斯公司、JT-12J電腦生物組織脫水機和包埋機購自武漢俊杰電子有限公司、C2500-R-230V微型高速離心機購自美國Labnet公司、ICV-450電熱恒溫培養箱購自日本ASONE公司、Multiskan MK3全自動酶標儀購自美國Thermo scientific公司、FC500流式細胞分析儀購自美國Beckman Coulter公司、1260高效液相色譜儀購自美國Agilent公司。

1.2動物分組、造模及給藥將120只大鼠按照隨機數字表法分為對照組，模型組，補脾強力復方低、中、高劑量組和西藥組，每組20只。將大鼠飼養在溫度（25±2）℃、濕度50%±10%、光/暗循環12 h的SPF級動物房中，普通顆粒飼料，自由取食和飲水，適應性飼養6周。實驗經貴州中醫藥大學實驗動物福利倫理委員會批準。第6周末，復制EAMG實驗動物模型［8］，首先將鼠源性R97-116、完全福氏佐劑（CFA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）按1∶1.5∶1.5體積比充分混勻制成免疫乳劑。取200 μL制備好的免疫乳劑皮下注射至大鼠足墊、腹部、背部等部位，對照組皮下注射等量PBS進行首次免疫。首次免疫后30及45 d，重新制備免疫乳劑（體積比R97-116∶CFA∶PBS=1∶3∶3），再取制備好的免疫乳劑200 μL強化接種，對照組在相同部位注射等量PBS。造模成功2周后進行灌胃治療，補脾強力復方低、中、高劑量組大鼠分別灌胃4.75、7.12、9.49 g/kg，西藥組大鼠灌胃5.4 mg/kg醋酸潑尼松片，灌胃體積為10 mL/kg，模型組和對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水，1次/d，連續灌胃4周。

1.3對各組大鼠行為學的觀察（1）各組大鼠體質量變化。（2）Lennon評分［9］：建模前、建模后和末次給藥后對各組大鼠進行Lennon評分。Lennon評分分為4級：0級，大鼠無明顯肌無力表現；1級，大鼠撕咬無力，四肢力量減弱，在光滑地面上大鼠前肢打滑，日常活動減少且容易疲勞；2級，大鼠行動明顯無力，休息時脊背隆起，腳趾明顯彎曲，頭尾下垂，動作笨拙，行走不穩；3級，大鼠出現嚴重無力現象，無撕咬動作，呼吸困難，瀕死甚至已死亡。癥狀居中間者分別評為0.5、1.5、2.5級。

1.4標本采集實驗結束時，將每組大鼠均分成2部分，一部分給予0.3%異戊巴比妥鈉1 mL麻醉處死，心臟采血，分離血清，-20℃冰箱保存待用；大鼠取胸腺置于預冷生理鹽水中洗滌，將胸腺放于KRT緩沖液中洗滌、研磨，并以60目尼龍網過濾，濾液1 200 r/min離心10 min，棄上清液。另一部分大鼠頸椎脫臼處死后立即放入乙醇中浸泡消毒，無菌條件下取出胸腺組織，剝離脂肪、血管和結締組織，洗滌，去除血細胞，置于盛有PBS培養皿中。采用Follicol法制備胸腺單核細胞懸液，用無菌注射器針芯和200目不銹鋼篩網研磨組織獲得單細胞懸液。4℃、800 r/min離心10 min，棄上清液，取細胞層，破裂紅細胞，PBS液洗2遍，臺盼藍染色液法檢測所分離細胞的活力＞90%。

1.5蘇木精-伊紅（HE）染色評估胸腺組織病理變化常溫下梯度乙醇對胸腺組織進行脫水處理，二甲苯透明后的組織塊浸蠟、包埋。包埋好的蠟塊經切片，脫蠟后放入蘇木素染液染色5 min，自來水浸洗返藍，將切片放入1%水溶性伊紅染液中染色5 min，水洗浸洗30 s，風干后中性樹膠封片，最后鏡檢。

1.6ELISA檢測血清AchR-Ab含量將實驗結束時收集的血樣以500×g離心15 min，取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測AchR-Ab水平。

1.7胸腺Treg細胞特征性表面標志物及相關細胞因子表達檢測取1.4制備的胸腺單核細胞懸液，使用流式細胞分析儀檢測EAMG大鼠胸腺中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例。使用TNF-β、IL-4和IL-10 ELISA試劑盒檢測大鼠血清Treg細胞相關因子水平，嚴格按照說明書分別加入各個試劑盒和待測樣組分，酶標儀檢測光密度值，根據標準曲線計算各樣本TNF-β、IL-4和IL-10含量。

1.8HPTT軸功能損傷指標檢測采用放射免疫分析法，按試劑盒說明書測定大鼠血清T3、T4、TSH和TRH水平；將大鼠斷頭取腦，冰盤上剖取皮層，勻漿，采用高效液相層析電化學檢驗法測定大鼠大腦皮層去甲腎上腺素（NE）含量；取大鼠下丘腦，加入1 mol/L鹽酸充分勻漿，采用放射配基分析法測定下丘腦T3受體（T3R）含量。

1.9統計學方法采用SPSS 21.0軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較用單因素方差分析（ANOVA）；組間多重比較時方差齊選用LSD-t法，方差不齊選用Tamhane’s T2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量和行為學變化建模前各組大鼠體質量比較差異無統計學意義（P＞0.05）；建模后，對照組大鼠的體質量大于其余5組（P＜0.05）；給藥后，補脾強力復方中、高劑量組和西藥組大鼠體質量較模型組升高（P＜0.05），見表1。建模前各組大鼠Lennon評分均為0分；建模后，各建模組大鼠Lennon評分較對照組升高（P＜0.05）；給藥后，補脾強力復方低、中、高劑量組和西藥組Lennon評分較模型組均降低，且高劑量組和西藥組Lennon評分較低、中劑量組降低（P＜0.05），見表2。

Tab.1 Changes of body mass of rats in each group表1各組大鼠體質量變化情況（n=20，g，±s）

Tab.1 Changes of body mass of rats in each group表1各組大鼠體質量變化情況（n=20，g，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組F建模前190.33±1.73 191.14±2.02 189.69±1.46 190.72±1.47 190.38±1.78 191.34±2.41 2.117建模后278.08±2.63 205.21±5.29a 201.44±3.00a 211.13±6.19a 209.66±5.46a 203.87±2.72a 928.100＊＊給藥后303.92±2.49 193.88±2.86a 208.63±3.04a 213.69±4.29ab 227.15±2.94ab 229.40±3.21ab 295.100＊＊

Tab.2 Changes of Lennon scores in each group表2各組大鼠Lennon評分變化（n=20，分，±s）

Tab.2 Changes of Lennon scores in each group表2各組大鼠Lennon評分變化（n=20，分，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與低劑量組比較，d與中劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組F建模前0 0 0 0 0 0-建模后0 2.1±0.3a 2.0±0.4a 1.9±0.5a 2.1±0.4a 2.2±0.3a 57.410＊＊給藥后0 2.5±0.3a 1.7±0.3ab 1.6±0.3ab 1.1±0.2abcd 1.2±0.2abcd 117.100＊＊

2.2 各組胸腺組織病理變化HE染色結果顯示，對照組胸腺細胞排列整齊，無淋巴細胞壞死。模型組皮質區淋巴細胞變性壞死，髓質區胸腺小體消失，細胞數量減少；補脾強力復方低、中、高劑量組及西藥組大鼠胸腺皮質區和髓質區細胞數量明顯增多，并且補脾強力復方的劑量越高，細胞數量增多越明顯。見圖1。

Fig.1 Pathological changes of thymus tissues assessed by HE staining(×200)圖1 HE染色評估胸腺組織病理變化（×200）

2.3 胸腺Treg細胞特征性表面標記物表達與對照組相比，模型組大鼠胸腺CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例下降（P＜0.05），CD4+CD25-Foxp3+和CD4+CD25+Foxp3-Treg細胞比例升高（P＜0.05）；與模型組相比，補脾強力復方中、高劑量組及西藥組大鼠胸腺CD4+CD25+和CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例升高（P＜0.05），CD4+CD25-Foxp3+和CD4+CD25+Foxp3-Treg細胞比例下降（P＜0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠血清AchR-Ab和胸腺Treg細胞相關細胞因子含量變化與對照組相比，模型組AchRAb、TNF-β、IL-4和IL-10水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，補脾強力復方中、高劑量組及西藥組AchR-Ab、TNF-β、IL-4和IL-10水平明顯降低（P＜0.05），見表4。

2.5 各組大鼠HPTT軸相關指標變化所有大鼠的T3、T4水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與對照組相比，模型組的T3R和NE水平下降（P＜0.05），TSH和TRH水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，補脾強力復方中、高劑量組及西藥組的T3R和NE水平升高（P＜0.05），TSH和TRH水 平 降 低（P＜0.05）。見表5。

Tab.3 Expression levels of characteristic surface markers of thymus Treg cells in each group of rats表3各組大鼠胸腺Treg細胞特征性表面標志物表達（n=10，%，±s）

Tab.3 Expression levels of characteristic surface markers of thymus Treg cells in each group of rats表3各組大鼠胸腺Treg細胞特征性表面標志物表達（n=10，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與低劑量組比較，d與中劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組F CD4+CD25+70.13±12.42 56.92±10.04a 61.82±11.78 67.99±14.52b 69.95±15.67bc 70.03±13.84bc 13.761＊＊CD4+CD25+Foxp3+75.58±12.64 49.21±6.02a 58.87±12.46a 63.77±13.40ab 71.24±12.78bcd 75.13±15.81bcd 6.857＊＊組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組F CD4+Foxp3+98.61±4.69 95.48±3.59 95.91±4.38 96.42±3.25 97.16±4.08 95.27±3.05 1.032 CD4+CD25-Foxp3+27.19±9.63 45.12±4.11a 38.44±3.03a 30.18±4.19bc 29.78±3.46bc 28.09±2.72bc 19.461＊＊CD4+CD25+Foxp3-2.59±0.96 4.18±0.62a 3.52±0.73 3.25±0.69b 2.83±0.57b 2.79±0.80b 6.374＊＊

Tab.4 Comparison of serum levels of AchR-Ab and thymus Treg cell-related factors between the six groups of rats表4各組大鼠血清AchR-Ab和胸腺Treg細胞相關因子含量比較 （n=10，±s）

Tab.4 Comparison of serum levels of AchR-Ab and thymus Treg cell-related factors between the six groups of rats表4各組大鼠血清AchR-Ab和胸腺Treg細胞相關因子含量比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與低劑量組比較，d與中劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組F AchR-Ab（pmol/L）0.23±0.05 0.45±0.04a 0.41±0.06a 0.38±0.05ab 0.26±0.08bcd 0.24±0.04bcd 30.516＊＊TNF-β（ng/L）58.26±6.69 89.18±9.59a 77.49±10.04ab 69.42±8.28abc 61.06±7.35bcd 59.56±6.57bcd 22.223＊＊IL-4（ng/L）42.13±9.73 68.83±15.83a 61.93±14.52a 58.24±12.34ab 49.39±11.53b 48.27±10.94b 6.143＊＊IL-10（ng/L）45.23±7.52 72.11±8.02a 68.37±9.46a 61.37±8.47ab 50.14±6.78bcd 48.63±7.41bcd 19.736＊＊

3 討論

HPTT軸調控胸腺自身免疫是MG發病的關鍵因素，絕大多數MG患者均伴有胸腺組織功能異常［10］。當切除胸腺后，大鼠MG癥狀得以有效緩解和改善，提示MG的發生與胸腺異常密切相關［11］。本研究發現，中、高劑量補脾強力復方對EAMG有良好的治療效果。綜合全方，補脾強力復方發揮作用的可能機制為：其一，補脾強力復方具有脾腎雙補的功效，MG以脾胃氣虛為本，補脾強力復方使先天充養富足，后天生化有源，因而脾胃氣虛可得以有效緩解。其二，補脾強力復方具有健脾化濕解毒，邪去正復等作用，用藥后氣血流暢，濕毒已去。其三，補脾強力復方可以活血化瘀，通調氣血，增精益血，有利于肌力恢復。全方共奏使脾腎雙補，氣血通常，筋肉得養［12-13］。

本研究結果顯示，與對照組相比，建模后其他各組大鼠體質量下降，Lennon評分升高，提示建模成功。給藥后，中、高劑量組和西藥組大鼠體質量較模型組升高，Lennon評分下降，提示經藥物治療后，從中劑量組開始治療已顯效。補脾強力復方低劑量組、中劑量組基本維持給藥前的肌無力癥狀或稍有好轉，但較給藥前癥狀變化不明顯。補脾強力復方高劑量組與西藥組Lennon評分明顯降低，肌無力癥狀均明顯好轉，提示高劑量補脾強力復方以及激素能夠明顯改善EAMG大鼠肌無力癥狀。HE染色結果顯示，使用補脾強力復方干預后，小鼠胸腺細胞數量增多，且隨著劑量的增加，皮質區和髓質區細胞數量增加更多，呈現劑量依賴性，提示補脾強力復方可改善胸腺組織病理損傷。

MG的病理基礎是AchR-Ab導致的神經肌肉神經突觸的相應受體破壞，因此降低AchR-Ab水平有助于治療MG和減緩MG進展［14］。本研究結果顯示，補脾強力復方中、高劑量組及西藥組AchR-Ab水平明顯降低，提示中、高劑量補脾強力復方可減少AchR-Ab表達，進而減少因AchR-Ab導致的受體破壞，恢復神經肌肉功能。本研究顯示，與模型組相比，補脾強力復方中、高劑量組及西藥組大鼠胸腺CD4+CD25+T、CD4+CD25+Foxp3+T細 胞 比 例 升 高，CD4+CD25-Foxp3+和CD4+CD25+Foxp3-比例下降。Foxp3是目前公認的CD4+CD25+T細胞的特異性標志，其基因水平調控CD4+CD25+T細胞的發育和成熟，FOXP3表達下調引發CD4+CD25+Treg細胞減少，機體免疫耐受被破壞，形成自身免疫損傷［15］。XU等［15］認為Treg細胞比例和數量的減少可能是MG發病的主要原因。本研究結果顯示，與模型組相比，補脾強力復方中、高劑量組及西藥組TNF-β、IL-4和IL-10水平明顯降低，提示高劑量補脾強力復方可能通過調節TNF-β、IL-4和IL-10等細胞因子，對Treg細胞表達比例進行調控。

Tab.5 Effects of Bupi Qiangli compound on functional impairment index of HPTT axis表5補脾強力復方對HPTT軸功能損傷指標的影響 （n=10，±s）

Tab.5 Effects of Bupi Qiangli compound on functional impairment index of HPTT axis表5補脾強力復方對HPTT軸功能損傷指標的影響 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與低劑量組比較，d與中劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組F T3（μg/L）1.92±0.26 1.87±0.19 1.94±0.21 1.88±0.10 1.93±0.25 1.82±0.07 0.551 T4（μg/L）119.41±9.49 112.05±10.43 116.23±10.13 111.89±17.06 110.99±11.55 111.42±16.22 0.698 T3R（fmol/mg DNA）178.51±32.63 125.32±45.29a 131.40±39.96a 155.41±36.19ab 169.57±45.46bcd 173.99±42.72bcd 3.100＊NE（ng/g）793.19±122.96 453.59±102.86a 508.96±113.04a 553.27±104.39ab 687.22±122.34bcd 696.24±123.31bcd 12.774＊＊TSH（μg/L）11.39±1.66 29.94±3.38a 26.61±2.34a 21.65±1.18bc 18.92±1.23abcd 19.82±1.40abcd 102.272＊＊TRH（ng/L）154.61±31.61 289.82±51.59a 227.19±51.42ab 195.26±45.26b 161.86±44.37bc 159.23±35.75bc 14.465＊＊

本研究結果顯示，所有大鼠T3、T4水平無明顯差異，補脾強力復方中、高劑量組T3R和NE水平較模型組明顯升高，TSH和TRH水平明顯降低。既往有研究顯示，HPTT軸能夠通過神經遞質及內分泌激素受體來實現免疫調控作用，從而影響所有的免疫功能［17］。下丘腦神經內分泌細胞產生TSH，隨血液進入垂體前葉，促進甲狀腺激素合成與釋放。TSH不僅能夠調節甲狀腺激素分泌，其在免疫系統中也具備突出的功能和意義，HPTT軸與免疫系統存在復雜而緊密的聯系，這其中TSH發揮了重要作用［18-20］。一般而言，TSH在T3和T4變化之前就發生改變，尤其亞臨床甲狀腺功能異常時僅有TSH水平的變化而不伴有明顯的T3和T4水平的改變，因此本研究中EAMG大鼠可能伴隨亞臨床甲減癥狀。既往研究表示，MG患者常伴有甲狀腺功能異常，可能是甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能低下或亞臨床甲狀腺功能減退，造成這種現象的原因可能是由于甲狀腺自身抗原的免疫交叉反應［21］。有研究發現，MG患者T3R減少，使TRH合成降低，進而影響垂體TSH合成［22］，說明MG患者的HPTT軸功能損傷后造成神經遞質和神經肽功能紊亂。

綜上所述，補脾強力復方可能通過干預HPTT軸，進而調節大鼠神經內分泌和免疫功能，改善EAMG大鼠自身免疫平衡。