白藜蘆醇通過BRD4調控Wnt/β-catenin通路逆轉膠質瘤細胞替莫唑胺耐藥的機制研究

李振江，孫德超，孔晨旭，耿亞東，徐晨陽，丁炳謙

膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，惡性度、發病率和復發率較高，預后較差［1］。替莫唑胺（TMZ）是治療膠質瘤的重要化學藥物，但多數患者容易出現TMZ耐藥現象［2］，故提高其療效十分重要。Wnt可通過經典及非經典途徑調控β-連環素（β-catenin）活性，調節細胞內目的基因表達，參與細胞增殖、遷移、凋亡等生理活動及腫瘤多藥耐藥性［3］。研究發現，抑制Wnt/β-catenin通路活性可阻斷依賴O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶（MGMT）的DNA修復途徑活化，降低膠質瘤細胞對TMZ的化療耐藥性，因此，Wnt/β-catenin通路有望成為提高膠質瘤TMZ化療療效的潛在干預靶點［4］。溴結構域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）是一種致癌因子，在多種腫瘤中高表達［5］。BRD4在膠質瘤組織中的表達水平與膠質瘤患者的總生存期呈負相關［6］。BRD4高表達可引起Wnt/β-catenin通路活化，抑制或降解BRD4可阻斷Wnt/β-catenin通路活化，發揮抗癌作用［6］。由此推測，BRD4可能與Wnt/β-catenin通路存在間接或直接聯系。白藜蘆醇（resveratrol，RES）為天然多酚類化合物，能通過多種生化作用發揮較為活躍的抗腫瘤作用［7］。RES具有脂溶性，可透過血腦屏障，發揮抗顱內腫瘤生長作用［8］。另外，RES可增強TMZ對腦膠質瘤的治療作用［9］，但其作用機制有待探究。本研究從BRD4及Wnt/β-catenin通路出發，探究RES提高膠質瘤細胞化療敏感性的機制，為提高膠質瘤化療效果提供參考。

1 材料與方法

1.1材料清潔級雄性NUDE大鼠20只，42～49日齡，體質量（230±5）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2021-0011。本研究符合3R原則。人神經膠質瘤TMZ低敏細胞株（U138）、耐藥株（T98G）購自ATCC；高敏細胞株（U251）購自中國科學院細胞資源中心；注射用TMZ購自江蘇恒瑞醫藥公司；RES、DMEM培養基購自Sigma公司；BRD4抑制劑JQ1購自MCE公司；Wnt3a/βcatenin通路激活劑LiCl購自Selleck公司；BRD4過表達質粒pcDNA BRD4及陰性對照質粒pcDNA NC由上海吉瑪基因公司合成；兔抗人BRD4、Wnt3a、β-catenin、Ki67抗體，小鼠抗人TMZ耐藥蛋白（MGMT）、內參β-actin抗體及羊抗兔或羊抗小鼠二抗購自Abcam公司；CCK-8試劑、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；酶標儀（型號：MultiskanTMFC）購自Thermo公司；流式細胞儀（型號：FACSCanto II）購自BD公司；凝膠成像系統（型號：Tanon 1600/1600R）購自Tanon公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及分組處理取適量U138、U251、T98G細胞37℃水浴復蘇后，于DMEM培養基（含10%胎牛血清）和恒溫培養箱中傳代培養、計數。取對數生長期T98G細胞，按1×106個/孔接種于6孔板內，進行如下處理：（1）不同濃度（0、5、10、50、100、200 μmoL/L）RES和不同濃度（0、10、50、100、200、400 μmoL/L）TMZ單獨培養，72 h后測定增殖活性，選擇50 μmoL/L RES及100 μmoL/L TMZ進行后續實驗。（2）設置對照1組（添加100 μmoL/L TMZ）、RES1組（添加50 μmoL/L RES）、RES+TMZ（同時添加100 μmoL/L TMZ和50 μmoL/L RES）組，培養72 h，另用CCK-8法繪制生長曲線并計算RES存在或不存在時細胞對TMZ的耐藥指數，耐藥指數=添加RES時半數抑制濃度（IC50）/未添加RES時IC50。（3）在添加100 μmoL/L TMZ的基礎上，對T98G細胞轉染pcDNA BRD4（或pcDNA NC）或加入50 μmoL/L RES2，分別作為pcDNA NC組、pcDNA BRD4組、RES2組、RES+pcDNA BRD4組。（4）參照文獻［10］和［11］在添加100 μmoL/L TMZ的基礎上加入250 nmoL/L JQ1或40 μmoL/L LiCl，依次作為對照2組、JQ1組、JQ1+LiCl組。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖取培養72 h的各組細胞，加入10 μL的CCK-8溶液干預培養4 h，讀取酶標儀450 nm波長處光密度（OD）值。根據OD值繪制生長曲線。細胞增殖活性（%）=（OD藥物-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡各組細胞培養72 h，取細胞，PBS洗滌、4℃加入75%冷乙醇固定過夜，PBS洗滌重懸細胞后順次加入Annexin V-FITC染色液、PI染液，混勻后4℃避光孵育30 min。流式細胞儀檢測凋亡率。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達取對數生長期U138、U251、T98G細胞粉碎勻漿后，提取蛋白并測定濃度，取蛋白100 μg行上樣、電泳及轉膜操作，滴加1∶800的一抗（BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT）及1∶900的β-actin抗體孵育過夜，二抗孵育50 min，化學發光法顯影曝光，凝膠成像系統拍照并計算條帶相對灰度值，以目的蛋白與內參蛋白的比值計算蛋白相對表達水平。

1.2.5裸鼠成瘤驗證RES的作用裸鼠麻醉后，向左側肩胛區皮下注射200 μL（1×106個細胞）T98G單細胞懸液，無菌條件下飼養12 d，注射部位有明顯瘤塊突起為成瘤成功［9］。按隨機數字表法將裸鼠分為對照治療組、TMZ治療組、RES+TMZ治療組、RES+TMZ+JQ1治療組，每組5只，對照治療組腹腔注射DMSO溶液，TMZ治療組腹腔注射50 mg/kg TMZ，RES+TMZ組在TMZ治療的基礎上，腹腔注射40 mg/kg RES治療［9］，RES+TMZ+JQ1組在RES+TMZ治療的基礎上給予1 mg/kg JQ1［10］腹腔注射治療。1次/d，連續給藥30 d后處死大鼠。取瘤體，4%多聚甲醛固定，制成5 μm的石蠟切片，脫蠟、水化、H2O2處理后，加入1∶200的一抗Ki67抗體孵育過夜，二抗孵育1 h，DAB顯色，置于光鏡下觀察拍照。Image J軟件計算單位面積內Ki67陽性染色的OD值。另用Western blot法檢測瘤體中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達。

1.3統計學方法采用SPSS 24.0軟件分析數據，符合正態分布的數據用±s表示，2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TMZ不同 敏 感 細胞株中BRD4、Wnt3a、βcatenin及MGMT蛋白表達變化比較與U251細胞相 比，U138、T98G的BRD4、Wnt3a、β-catenin及MGMT表達依次升高（P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1 Immunoblot of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression in different sensitive cell lines of TMZ圖1 TMZ不同敏感細胞株中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達免疫印跡圖

Tab.1 Comparison of protein expressions of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT between different sensitive cell lines of TMZ表1 TMZ不同敏感細胞株中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達比較 （n=6，±s）

Tab.1 Comparison of protein expressions of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT between different sensitive cell lines of TMZ表1 TMZ不同敏感細胞株中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；aU251相比，b與U138相比，P＜0.05。

細胞系U251 U138 T98G F BRD4 0.38±0.06 0.91±0.11a 1.85±0.21ab 166.826＊＊Wnt3a 0.42±0.07 1.23±0.13a 2.09±0.28ab 125.287＊＊β-catenin 0.26±0.05 1.52±0.14a 2.17±0.26ab 189.237＊＊MGMT 0.63±0.07 1.78±0.12a 2.69±0.24ab 249.449＊＊

2.2 RES對T98G細胞增殖、凋亡、耐藥性、BRD4及Wnt3a/β-catenin通路的影響0、5、10、50、100、200 μmoL/L RES單獨處理T98G細胞72 h，當其濃度為5～50 μmoL/L時，細胞增殖活性下降，并在50～200 μmoL/L時保持穩定，見圖2。選擇50 μmoL/L RES進行后續實驗。

Fig.2 Effects of different concentrations of RES on the proliferation activity of T98G cells圖2不同濃度RES對T98G細胞增殖活性的影響

0、10 、50、100、200、400 μmoL/L TMZ單獨處理T98G細胞72 h，當濃度為10～100 μmoL/L時，細胞增殖活性下降，并在100～400 μmoL/L時保持穩定，見圖3。選擇100 μmoL/L TMZ進行后續實驗。

Fig.3 The effect of different concentrations of TMZ on the proliferation activity of T98G cells圖3不同濃度TMZ對T98G細胞增殖活性的影響

與對照1組相比，RES1組、RES+TMZ組T98G細胞凋亡率依次升高，BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達及細胞增殖活性依次降低（P＜0.05），見圖4、5，表2。

Fig.4 Flow cytometry chart of apoptosis of T98G cells in each group圖4各組T98G細胞流式凋亡圖

Fig.5 Immunoblot results of BRD4,Wnt3a,β-catenin,MGMT protein expression圖5 BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達免疫印跡圖

Tab.2 Effects of RES on the proliferation activity,apoptosis rate and protein expression of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT in T98G cells表2 RES對T98G細胞增殖活性、凋亡率及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達的影響（n=6，±s）

Tab.2 Effects of RES on the proliferation activity,apoptosis rate and protein expression of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT in T98G cells表2 RES對T98G細胞增殖活性、凋亡率及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達的影響（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照1組相比，b與RES1組相比，P＜0.05。

組別對照1組RES1組RES+TMZ組F增殖活性（%）100.00±5.06 51.19±6.71a 25.47±2.63ab 332.660＊＊凋亡率（%）9.14±2.13 23.19±4.08a 45.36±6.52ab 94.239＊＊BRD4 1.78±0.19 1.36±0.27a 0.74±0.12b 39.929＊＊組別對照1組RES1組RES+TMZ組F Wnt3a 1.32±0.18 0.93±0.16a 0.42±0.11b 52.305＊＊β-catenin 1.86±0.33 1.47±0.12a 0.65±0.18b 44.096＊＊MGMT 2.19±0.48 1.68±0.23a 1.04±0.13b 19.909＊＊

生 長 曲 線 見 圖6，RES干 預 時，T98G細 胞TMZIC50、耐藥指數分別為（53.47±5.40）μmoL/L、0.53±0.05，顯著低于無RES時的（100.08±9.14）μmoL/L、1.00±0.08（tTMZIC50=10.755，t耐藥指數=12.203，均P＜0.05）。

2.3 過表達BRD4可減弱RES對T98G細胞TMZ耐藥性的逆轉作用與pcDNA NC組相比，pcDNA BRD4組T98G細胞BRD4蛋白表達升高（P＜0.05），見圖7、表3。與pcDNA NC組相比，pcDNA BRD4組T98G細胞Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達及增殖活性升高，凋亡率降低（P＜0.05）；與RES2組相比，RES+pcDNA BRD4組Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達及增殖活性升高，凋亡率降低（P＜0.05），見圖7、8，表3。

Fig.6 The effect of RES on TMZIC50 in T98G cells圖6 RES對T98G細胞TMZIC50的影響

Fig.7 Western blot assay of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression圖7 BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達免疫印跡圖

2.4 BRD4對Wnt3a/β-catenin通路的影響相比對照2組，JQ1組增殖活性及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達水平降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05）。與JQ1組相比，JQ1+LiCl組增殖活性、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達升高，凋亡率降低（P＜0.05），見圖9、10，表4。

2.5 RES的體內實驗驗證結果與對照治療組相比，TMZ治療組瘤 體 中Ki67、BRD4、Wnt3a、βcatenin、MGMT蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與TMZ治療組相比，RES+TMZ治療組、RES+TMZ+JQ1治療 組瘤 體 中Ki67、BRD4、Wnt3a、βcatenin、MGMT蛋白表達降低（P＜0.05），且RES+TMZ+JQ1組瘤體中Ki67及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達最低（P＜0.05），見圖11、12，表5。

3 討論

Fig.8 Flow cytometry chart of apoptosis of T98G cells圖8 T98G細胞流式凋亡圖

Tab.3 Comparison of cell proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the four groups表3各組細胞增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達比較 （n=6，±s）

Tab.3 Comparison of cell proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the four groups表3各組細胞增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與pcDNA NC組相比，b與pcDNA BRD4組相比，c與RES2組相比，P＜0.05。

組別pcDNA NC組pcDNA BRD4組RES2組RES+pcDNA BRD4組F增殖活性（%）100.02±6.18 160.73±15.02a 51.23±6.84a 93.42±7.15bc 134.977＊＊凋亡率（%）9.16±1.09 2.74±0.16a 22.36±5.07a 13.75±1.26bc 57.308＊＊BRD4 1.78±0.19 2.53±0.26a 1.32±0.28a 1.96±0.41 17.162＊＊Wnt3a 1.32±0.18 2.45±0.31a 0.92±0.25a 1.76±0.19bc 45.382＊＊β-catenin 1.86±0.33 2.84±0.37a 1.42±0.18a 2.15±0.37bc 20.542＊＊MGMT 2.07±0.38 2.95±0.41a 1.57±0.15a 2.51±0.17bc 23.081＊＊

Fig.9 Flow cytometry chart of apoptosis of T98G cells圖9 T98G細胞流式凋亡圖

Tab.4 Comparison of proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the three groups表4各組增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達的比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the three groups表4各組增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達的比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照2組相比，b與JQ1組相比，P＜0.05。

組別對照2組JQ1組JQ1+LiCl組F增殖活性（%）100.00±6.43 51.19±7.42a 98.23±7.51b 92.280＊＊凋亡率（%）11.43±3.15 29.15±3.87a 13.46±3.21b 48.089＊＊BRD4 1.69±0.13 1.28±0.17a 1.25±0.19 13.282＊＊Wnt3a 1.31±0.19 0.89±0.07a 1.25±0.09b 18.916＊＊β-catenin 1.84±0.32 1.36±0.17a 1.79±0.12b 8.603＊＊MGMT 2.15±0.23 1.82±0.09a 2.09±0.11b 7.609＊＊

膠質瘤占腦部腫瘤的半數以上，是神經外科最難治療的腫瘤［12］。TMZ是臨床治療膠質瘤的有效藥物，但有48%～58%的患者對TMZ化療不敏感［13］，故探尋膠質瘤化療耐藥的分子機制對提高TMZ化療效果有重要意義。

TMZ可通過甲基化DNA分子并使DNA在復制過程中出現堿基錯配，引起DNA鏈斷裂、損傷，發揮細胞毒性作用［14］。但MGMT表達升高后可轉移鳥嘌呤上的烷化基團，阻斷DNA損傷，介導耐藥性產生［15］。如何干預MGMT表達已成為提高膠質瘤TMZ化療敏感性的重要研究方向。有研究發現，Wnt/β-catenin通路活化是引起MGMT抗藥修復系統激活的關鍵原因［16］。Wnt通路被激活時，Wnt與相關受體結合后會促進細胞質中β-catenin進入細胞核，調節增殖、生長及耐藥蛋白如P-糖蛋白等基因轉錄，介導多重耐藥［17］。此外，Wnt/β-catenin通路已被認為參與MGMT的轉錄調控過程［18］。本研究發現，高敏株、低敏株、耐藥株中的MGMT及Wnt/βcatenin通路蛋白表達依次升高，提示Wnt3a/βcatenin通路活化與膠質瘤TMZ耐藥密切相關。但引起Wnt3a/β-catenin通路活化的上游調控機制還不明確。

Fig.10 Immunoblot results of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression圖10 BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達免疫印跡圖

Fig.11 Immunohistochemical staining showing Ki67 in tumor圖11瘤體內Ki67免疫組化染色圖（標尺：50 μm）

Fig.12 Immunoblot results of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression in tumor圖12瘤體中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達免疫印跡圖

Tab.5 Comparison of Ki67,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expressions in tumors between the four groups表5瘤體中Ki67、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達比較 （n=5，±s）

Tab.5 Comparison of Ki67,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expressions in tumors between the four groups表5瘤體中Ki67、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達比較 （n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與TMZ治療組相比，b與RES+TMZ組相比，P＜0.05。

組別對照治療組TMZ治療組RES+TMZ治療組RES+TMZ+JQ1治療組F Ki67（光密度/mm2）2.13±0.18 2.10±0.21 1.47±0.13a 0.85±0.09ab 72.557＊＊BRD4 1.57±0.10 1.53±0.12 1.18±0.15a 0.61±0.11ab 66.924＊＊Wnt3a 1.83±0.14 1.82±0.18 1.27±0.12a 0.53±0.06ab 107.569＊＊β-catenin 1.25±0.16 1.23±0.15 0.96±0.12a 0.48±0.07ab 38.160＊＊MGMT 2.13±0.17 2.10±0.14 1.71±0.19a 1.06±0.12ab 50.141＊＊

BRD4可間接或直接引起Wnt3a/β-catenin通路活化而發揮致癌及促癌作用。BRD4能驅動原癌基因（C-MYC）、凋亡調節因子（BCL-2）、程序性細胞死亡蛋白-1（PD-1）等關鍵致癌基因轉錄，加速腫瘤發展，還可激活DNA損傷檢查點來修復損傷DNA，提高癌細胞防御外界損傷的能力［19］。另外，BRD4能夠通過調節miR-142-5p、miR-216-3p等的表達，進而影響其靶基因Wnt3a表達，促進Wnt/β-catenin通路活化，參與癌癥的發展［6，20］。本研究發現，高敏株、低敏株、耐藥株中的BRD4表達也逐漸升高。使用BRD4抑制劑JQ1可顯著抑制BRD4表達，同時抑制T98G細胞增殖及Wnt3a/β-catenin、MGMT蛋白表達，促進其凋亡，提高其對TMZ化療的敏感性；反之，Wnt/β-catenin通路激活劑可減弱JQ1的上述作用，提示BRD4可調控Wnt3a/β-catenin通路活化，參與膠質瘤TMZ耐藥。

RES具有抗氧化、抗炎、促進自噬、調控線粒體呼吸功能等作用［21］。研究發現，RES還能與順鉑、TMZ等化療藥物協同作用，降低化療藥物誘導細胞死亡的閾值，提高化療效果［7，9］。本研究也發現，RES在提高膠質瘤對TMZ化療敏感性的同時，還可抑 制BRD4、Wnt3a/β-catenin及MGMT表 達，且BRD4高表達可明顯減弱RES對T98G細胞TMZ耐藥性的逆轉作用，提示RES對T98G細胞TMZ耐藥性的逆轉作用可能與抑制BRD4、Wnt3a/β-catenin及MGMT表達有關。另外，體內實驗也發現，與TMZ治療相比，RES+TMZ治療組、RES+TMZ+JQ1治療組瘤體中Ki67、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達降低，提示RES可激活TMZ對瘤體內Wnt3a/βcatenin通路、MGMT表達和細胞增殖的抑制作用，JQ1可加強上述作用。

綜上所述，RES可能通過下調BRD4，進而抑制Wnt3a/β-catenin通路活化，實現對膠質瘤T98G細胞TMZ耐藥性的逆轉。本研究為闡明膠質瘤TMZ化療耐藥性產生的分子機制提供了一定參考，也為治療膠質瘤提供了新的化療思路。但BRD4、Wnt3a/β-catenin及MGMT之間的靶向關系仍需繼續探究。