棕櫚酰化修飾的NOD2在失血性休克動物模型中的作用

谷子，唐勇，周程繼，鄭強

失血性休克（hemorrhagic shock，HS）及組織再灌注時會產(chǎn)生大量的氧自由基，后者可作為信息分子廣泛激活炎癥系統(tǒng)［1］，促使大量炎性細胞在內(nèi)臟組織中聚集，并產(chǎn)生大量的細胞因子、趨化因子及其他炎性介質(zhì)，引起循環(huán)衰竭和器官損傷［2］，其中最早且最典型的便是引起急性肺損傷（acute lung injury，ALI）［3］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2（nucleotidebinding oligomerzation domain 2，NOD2）通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別損傷相關(guān)分子模式，誘導多種炎性介質(zhì)和生長因子的釋放［4］。HS時，高 遷移 率 族 蛋 白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）誘導增強NOD2的表達，通過激活核因子（NF）-κB而促使細胞釋放炎性因子［5］。細菌免疫時，HMGB1誘導增強NOD2的表達，增強表達的NOD2需在棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶ZDHHC5的調(diào)控下產(chǎn)生棕櫚酰化修飾的NOD2，NOD2識別并誘發(fā)細胞內(nèi)NOD2介導的免疫應(yīng)答，通過激活NF-κB促使細胞釋放炎癥因子［6］。不同的是，細菌免疫時NOD2還需經(jīng)ZDHHC5的調(diào)控產(chǎn)生棕櫚酰化修飾的NOD2而發(fā)揮作用。那么HS時，NOD2是否也需經(jīng)ZDHHC5的調(diào)控產(chǎn)生棕櫚酰化修飾的NOD2發(fā)揮作用？本研究擬采用定壓型HS大鼠模型，探討HS及組織再灌注時NOD2在HS及缺血再灌注時對器官損傷的作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料及儀器8周齡的體質(zhì)量250～300 g SPF級雄性NOD2基因敲除SD大鼠10只和普通SD大鼠30只，購自成都達碩生物科技有限公司［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-030］。腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β、IL-6檢測試劑盒購自四川邁克科技有限公司；HMGB1、ZDHHC5及NOD2檢測試劑盒購自成都派克生物技術(shù)有限公司；丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）檢測試劑盒、DAPA染色液購自武漢六合生物技術(shù)有限公司；兔源棕櫚酰化修飾酶（PAT）抗體和兔源NOD2抗體購自美國Sigma公司；兔源HMGB1、ZDHHC5、NOD2一抗及鼠源β-actin一抗購自美國Santa公司；羊抗兔及羊抗鼠二抗購自上海基因科技有限公司。鼠源熒光單抗購自美國Millipore公司；抗鼠熒光二抗購自美國Invitrogen公司。ABL90血氣分析儀由雷度米特公司提供；SAR-1000型動物呼吸機由世聯(lián)博研（北京）科技有限公司提供。熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置、凝膠成像儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型制備10只NOD2基因敲除SD大鼠，制備動物模型：使用1%戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，固定。氣管插管成功后連接呼吸機（潮氣量2 mL，呼吸頻率55次/min），吸入氣體的氧濃度分數(shù)（Fraction of inspiration O2，F(xiàn)IO2）25%，通過吸入1%異氟醚來維持麻醉。外科手術(shù)分離左右股動、靜脈并置管，右股動脈連接壓力轉(zhuǎn)換器（Pclab-530C生物醫(yī)學信號采集系統(tǒng)）,左股動脈抽血，右股靜脈用于液體輸注。使用加熱墊和加熱燈使動物體溫保持在37℃。通過左股動脈失血使平均動脈壓（MAP）迅速降低至（35.0±2.0）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），通過失血控制后維持30 min。收集血液后肝素化（肝素7.5 IU/mL），保持在35℃，并經(jīng)常搖動。造模成功后設(shè)為對照組。另30只普通SD大鼠經(jīng)動物模型制備（方法同上）后，按隨機數(shù)字表法分為3組：空白組、anti-PAT組及anti-NOD2組，每組10只。通過股靜脈通道分別給對照組予生理鹽水，空白組予生理鹽水，anti-PAT組予PAT抗體（1 mg/kg），anti-NOD2組予NOD2抗體（200 mg/kg），后給予4組大鼠生理鹽水進行液體復蘇15 min，45 min后使其MAP控制在（50.0±2.0）mmHg，并維持60 min。105 min后，予以血液回輸及生理鹽水復蘇15 min，120 min后使其MAP控制在≥80 mmHg，并維持120 min。240 min后拔出氣管插管及動靜脈置管，進行血管止血并縫合切口后將大鼠放回籠內(nèi)，自由飲食，24 h后采集血液標本，再將其處死并采集肺組織。

1.2.2標本處理將2 mL血液標本以3 000 r/min離心15 min，取血漿于-70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ? g肺組織加入1 mL蒸餾水，充分研磨后，6 000 r/min離心15 min，取上清液，于-70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩２糠址谓M織用4%多聚甲醛固定。

1.2.3血氣分析在實驗開始、休克初期及再灌注后2 h分別進行血氣分析，包括酸堿度（pH）、氧分壓［p（O2）］、二氧化碳分壓［p（CO2）］、實際碳酸氫根（HCO3-）、堿剩余（BE）和乳酸（Lac）值。

1.2.4TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA及MPO檢測酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血漿TNF-α、IL-1β和IL-6水平；比色法檢測肺組織MDA水平；硫代巴比妥酸（TBA）法檢測肺組織MPO水平。

1.2.5Western blot法檢測肺組織HMGB1、ZDHHC5及NOD2表達水平取100 mg肺組織，每組10個標本，加入蛋白裂解液，提取蛋白，用酶標儀測定蛋白濃度。隨后每組取30 μg蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉封 閉，PBS洗膜后，分別加入HMGB1、ZDHHC5、NOD2及β-actin一抗（均1∶1 000），4℃孵育12 h，洗膜后加入二抗（均1∶10 000），37℃孵育1 h，用化學發(fā)光劑避光反應(yīng)，將PVDF膜放至暗室中曝光顯影。應(yīng)用Image J軟件對檢測結(jié)果的灰度值進行分析，以β-actin為內(nèi)參照，目標蛋白與其相比進行分析。

1.2.6棕櫚酰化修飾的NOD2免疫熒光分析取厚度為8 μm的脫水肺組織，用PBS洗滌3次，每次10 min。擦干后滴加0.2%Triton X-100，打孔15 min。用PBS洗滌3次，每次10 min。擦干后滴加一抗，放于濕盒中4℃孵育過夜。用PBS洗滌3次，每次10 min。滴加二抗，放于濕盒中避光孵育2 h。用PBS洗滌3次，每次10 min。滴加DAPI，室溫5 min染細胞核，用PBS洗滌3次，每次10 min。擦干滴加抗熒光封片劑封片。置于顯微鏡下觀察。

1.2.7肺組織病理分析取4%多聚甲醛固定的肺組織，乙醇脫水、二甲苯浸泡、浸蠟、石蠟包埋、切片、附貼，HE染色后由2位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師采用盲法對每個標本進行病理學分析。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間差異比較用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

Fig.1 MAP and heart rate computer acquisition map of hemorrhagic shock model圖1失血性休克模型MAP和心率電腦采集圖

2 結(jié)果

2.1 失血性休克動物模型的基本資料0、30、45、120 min MAP分 別 為（132.2±17.5）、（37.6±2.8）、（53.4±2.8）、（115.5±15.6）mmHg。符合實驗失血性休克各階段建模要求，見圖1。

2.2 各組血氣指標比較240 min時，對照組、anti-PAT組和anti-NOD2組p（O2）均高于空白組（P＜0.05）；30 min及240 min時對照組、anti-PAT組和anti-NOD2組Lac水平均低于空白組（P＜0.05），見表1。

2.3 各組炎性因子水平比較對照組、anti-PAT組和anti-NOD2組的TNF-α、IL-1β、MDA及MPO水平均低于空白組（P＜0.05），該3組指標水平依次增高（P＜0.05）；對照組、anti-PAT組和anti-NOD2組的IL-6水平均低于空白組（P＜0.05），且anti-PAT組和anti-NOD2組高于對照組（P＜0.05），見表2。

Tab.1 Comparison of blood gas indexes between four groups表1各組血氣指標比較 （n=10，±s）

Tab.1 Comparison of blood gas indexes between four groups表1各組血氣指標比較 （n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與對照組比較，P＜0.05。

組別空白組對照組anti-PAT組anti-NOD2組F pH 0 min 7.39±0.01 7.40±0.01 7.39±0.01 7.40±0.01 0.655 30 min 7.21±0.01 7.21±0.01 7.23±0.01ab 7.22±0.02 2.692＊240 min 7.39±0.01 7.40±0.01 7.39±0.01 7.39±0.01 1.380 p（O2）（mmHg）0 min 97.1±1.1 97.0±0.8 97.9±1.1 97.4±1.1 1.555 30 min 80.2±1.1 81.4±1.8 81.2±1.5 80.8±1.6 1.165 240 min 82.0±2.5 92.8±1.4a 94.6±1.5ab 94.0±1.9a 101.480＊＊p（CO2）（mmHg）0 min 40.7±1.2 40.0±0.9 40.3±0.9 40.4±0.9 1.160 30 min 30.5±1.1 31.1±1.4 30.7±1.4 31.0±0.9 0.396 240 min 40.9±2.1 42.3±1.7 42.4±1.9 42.9±2.0a 1.849＊組別空白組對照組anti-PAT組anti-NOD2組F HCO3-（mmol/L）0 min 23.2±0.4 23.2±0.7 23.4±0.5 23.4±0.5 0.414 30 min 13.0±0.8 13.3±1.0 13.1±0.7 13.2±1.1 0.193 240 min 20.8±0.4 21.4±0.8 21.9±1.2a 21.2±1.2 2.509＊BE（mmol/L）0 min 3.5±0.3 3.6±0.3 3.8±0.3a 3.7±0.3 1.605＊30 min-16.4±0.6-16.0±0.7-16.2±0.7-16.2±0.7 0.701 240 min-7.2±0.6-7.2±0.5-6.9±0.6-7.1±0.4 0.697 Lac（mmol/L）0 min 1.5±0.2 1.5±0.2 1.5±0.2 1.5±0.2 0.025 30 min 15.2±1.1 12.4±0.7a 12.6±0.8a 12.8±0.6a 27.054＊＊240 min 14.9±1.4 5.3±0.6a 5.0±0.6a 5.3±0.4a 326.881＊＊

Tab.2 Comparison of inflammatory factors between four groups表2各組炎性因子水平比較 （n=10，±s）

Tab.2 Comparison of inflammatory factors between four groups表2各組炎性因子水平比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與對照組比較，c與anti-PAT組比較，P＜0.05。

組別空白組對照組anti-PAT組anti-NOD2組F TNF-α（ng/L）216.4±12.0 34.7±2.4a 141.6±3.8ab 153.8±4.7abc 1 224.163＊＊IL-1β（ng/L）152.6±6.1 22.7±1.4a 86.5±5.7ab 91.0±4.9abc 1 168.905＊＊IL-6（ng/L）103.1±6.0 22.2±3.3a 61.4±5.5ab 63.0±5.2ab 424.840＊＊MDA（μmol/g）167.3±10.7 31.0±2.1a 88.2±6.0ab 103.6±8.0abc 573.928＊＊MPO（μg/L）226.1±12.5 50.1±3.6a 127.0±6.4ab 138.2±7.0abc 797.415＊＊

2.4 各組HMGB1、NOD2和ZDHHC5蛋白表達水平比較Western blot結(jié)果顯示，對照組、anti-PAT組和anti-NOD2組的HMGB1、NOD2和ZDHHC5的表達量均低于空白組（P＜0.05）；該3組HMGB1、NOD2的表達量依次增高（P＜0.05），見圖2、表3。

Fig.2 Western blot analysis of HMGB1,NOD2 and ZDHHC5 proteins in animal model lung tissue圖2動物模型肺組織的HMGB1、NOD2和ZDHHC5蛋白免疫印跡分析

2.5 各組棕櫚酰化修飾的NOD2免疫熒光及病理結(jié)果肺組織棕櫚酰化修飾的NOD2的免疫熒光可見，空白組棕櫚酰化修飾的NOD2的免疫熒光表達量明顯高于對照組、anti-PAT組及anti-NOD2組，見圖3。動物模型肺組織的病理切片可見，空白組較對照組、anti-PAT組及anti-NOD2組肺泡內(nèi)皮及肺泡組織破壞明顯，炎性細胞浸潤明顯，見圖4。

Tab.3 Comparison of HMGB1,NOD2 and ZDHHC5 between four groups表3各組肺組織HMGB1、NOD2和ZDHHC5表達水平比較 （n=10，±s）

Tab.3 Comparison of HMGB1,NOD2 and ZDHHC5 between four groups表3各組肺組織HMGB1、NOD2和ZDHHC5表達水平比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與對照組比較，c與anti-PAT組比較，P＜0.05。

組別空白組對照組anti-PAT組anti-NOD2組F HMGB1 2.10±0.04 0.75±0.07a 1.26±0.20ab 1.45±0.10abc 221.503＊＊NOD2 1.26±0.12 0.19±0.03a 0.54±0.06ab 0.65±0.06abc 365.514＊＊ZDHHC5 1.39±0.11 1.17±0.16a 0.56±0.10ab 1.03±0.08abc 90.836＊＊

3 討論

3.1 NOD2與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)N樣受體（N like receptors，NLRs）是模式識別受體家族中的主要受體，在NLRs家族中共有22個成員，其中最具代表性的是NOD2［7］。研究發(fā)現(xiàn)，NOD2基因的變異與克羅恩病（Crohn′s disease，CD）［8］和Blau綜合征（Blau syndrome，BS）［9］有關(guān)。且有研究發(fā)現(xiàn)NOD2與動脈粥樣硬化［10］、老年癡呆［11］和糖尿病［12］等多種疾病的發(fā)病機制有關(guān)。Kim等［13］提出，在腎臟缺血再灌注過程中，NOD2可誘導機體產(chǎn)生大量細胞因子、趨化因子及其他炎性介質(zhì)，對腎臟產(chǎn)生損傷。還有研究指出，當HS發(fā)生時，NOD2通過激活NF-κB信號通路導致肺部炎癥增加，誘發(fā)ALI［14］。ZDHHC結(jié)構(gòu)域蛋白家族是一類與蛋白質(zhì)翻譯后的棕櫚酰化修飾作用相關(guān)的蛋白，這類蛋白大多具有PAT活性。Dante Neculai團隊揭示了在細菌免疫時NOD2的棕櫚酰化修飾介導細胞內(nèi)源性免疫損傷的重要機制，該研究指出NOD2的棕櫚酰化修飾是影響其亞細胞定位及正確免疫應(yīng)答功能的關(guān)鍵因素，并鑒定了NOD2棕櫚酰化的發(fā)生位點及相應(yīng)的棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶ZDHHC5，提出棕櫚酰化修飾的NOD2能夠識別并誘發(fā)細胞內(nèi)NOD2介導的免疫損傷應(yīng)答，通過激活NF-κB信號通路從而促使細胞釋放炎癥因子［15］。HS及組織再灌注時，組織產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基可作為信息分子廣泛激活炎癥系統(tǒng)，導致全身性炎癥反應(yīng)綜合征。NOD2通過PRRs識別損傷相關(guān)分子模式誘導多種炎性介質(zhì)和生長因子的釋放。HS時，HMGB1可誘導增強NOD2的表達，通過激活NF-κB信號通路從而促使細胞釋放炎性因子［16］。那么，HS時NOD2是否也需經(jīng)ZDHHC5的調(diào)控產(chǎn)生棕櫚酰化修飾的NOD2，并產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，從而引起器官損傷值得深入研究。因此，本研究擬采用定壓型HS大鼠模型，探討HS及組織再灌注發(fā)生時NOD2對器官損傷的作用及機制。

Fig.3 Immunofluorescence staining results of palmitoylated NOD2 in lung tissues of four groups(×400)圖3各組肺組織的棕櫚酰化修飾的NOD2的免疫熒光染色結(jié)果（×400）

Fig.4 Pathological sections of lung tissues in four groups(HE staining,×200)圖4各組肺組織病理切片（HE染色，×200）

3.2 HS及缺血再灌注時NOD2對炎性因子的影響TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA及MPO等是目前主要的炎性因子，上述炎性因子聚集在炎癥部位而發(fā)生氧化反應(yīng)，進而形成大量超氧化物和氧化物，導致廣泛的炎癥反應(yīng)，最終損傷細胞及組織器官［17］。本研究顯示，對照組、anti-PAT組和anti-NOD2組的TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA及MPO水平低于空白組，且后兩組的水平高于對照組。說明當HS及缺血再灌注時，NOD2可促使TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA及MPO炎性因子釋放增加。

3.3 HS及缺血再灌注時肺組織炎性因子調(diào)控蛋白的變化HMGB1可調(diào)控核小體穩(wěn)定和DNA的重組復制、修復及轉(zhuǎn)錄，誘導TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA及MPO等炎性因子的釋放，進而造成多種組織細胞及器官損傷［18］。本研究顯示，對照組、anti-PAT組和anti-NOD2組的HMGB1的表達量均低于空白組，后2組HMGB1的表達量高于對照組。從各組血氣分析及乳酸水平可以看出，240 min時對照組、anti-PAT組和anti-NOD2組的p（O2）水平均高于空白組；30 min及240 min時3組的乳酸水平均低于空白組。說明當HS及缺血再灌注時，動物模型發(fā)生了ALI。肺病理切片結(jié)果顯示，對照組較其他3組肺泡內(nèi)皮及肺泡組織明顯破壞、炎性細胞浸潤明顯，更加驗證了HS及缺血再灌注早期便可發(fā)生ALI。以上結(jié)果說明當HS及缺血再灌注時，NOD2可促使HMGB1蛋白的合成增加，進而增加多種炎性因子的釋放，造成ALI。Western blot結(jié)果顯示，對照組、anti-PAT組和anti-NOD2組的NOD2和ZDHHC5的表達量均低于空白組；后兩組NOD2和ZDHHC5的表達量均高于對照組。說明當HS及缺血再灌注時，NOD2在ZDHHC5的調(diào)控下產(chǎn)生棕櫚酰化修飾的NOD2。

綜上所述，在失血性休克及缺血再灌注動物模型中，HMGB1可 誘 導增 強NOD2的表達，NOD2在ZDHHC5的調(diào)控下產(chǎn)生棕櫚酰化修飾的NOD2，從而促使細胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA及MPO等炎性因子，損傷肺組織。這將為臨床搶救失血性休克患者，預(yù)防ALI提供參考及干預(yù)的靶點。