小鼠胰腺對梯度膽囊收縮素的應答

武平，胡立娟，徐曉晴，李秋菊，姚傳山，王豐△

肽類激素膽囊收縮素/促胰酶素（cholecystokinin，CCK）可調(diào)節(jié)消化吸收過程，刺激胰腺生長，也可參與胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）的發(fā)生發(fā)展［1］。食物經(jīng)過胃的初步消化后，經(jīng)胃排空分批進入十二指腸和近端空腸。此時食糜中的蛋白和脂肪分解物會刺激小腸黏膜中的I細胞（I cell），使其向血中釋放CCK［2］。CCK刺激膽囊和胃幽門的收縮及十二指腸壺腹括約肌的舒張，使胃排空暫停并使膽胰液進入腸腔。隨后胰液中的胰蛋白酶會抑制I細胞的CCK分泌，使CCK的效應逐漸減弱。隨著膽胰液和食糜混合物抵達遠端腸管，相對低的CCK血濃度會導致胃排空的再次發(fā)生，而進入腸道的食糜則引發(fā)新一輪的CCK分泌及CCK效應［2］。如此循環(huán)往復直至胃內(nèi)容物被全部排空［2］。大豆胰蛋白酶抑制劑（soybean trypsin inhibitor，STI）可使I細胞的CCK分泌不再受到胰蛋白酶的抑制，從而誘發(fā)高CCK血癥［3］。胰腺包埋化學致癌物二甲基苯并蒽（dimethylbenzanthracene，DMBA）可誘導胰腺癌前病變-胰腺上皮內(nèi)瘤變（pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN）［4］。有研究表明，綠茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）對多種癌癥具有潛在的療效［5］。既往有關(guān)CCK的研究多將血CCK升高到某單一水平，而不同程度高CCK血癥是否在靶器官引發(fā)梯度效應尚未明確，且高CCK血癥對胰腺的生理調(diào)節(jié)及在胰腺癌進展過程中的作用仍存在爭議。本研究給予小鼠不同劑量STI，使循環(huán)中的CCK水平呈梯度增高，探討CCK對胰腺生長、消化酶生成的調(diào)節(jié)作用及胰腺癌發(fā)生的影響，并評估EGCG的抗癌潛能。

1 材料與方法

1.1實驗材料5～6周齡雄性C57BL/6小鼠58只，體質(zhì)量18～20 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)于南開醫(yī)院SPF級實驗動物中心。小鼠接受12 h/12 h晝夜循環(huán)光照，自由攝食和飲水，經(jīng)1周適應性喂養(yǎng)后進行后續(xù)實驗。STI（批號210610，抑制胰蛋白酶活性≥3 000 U/mg，上海如吉生物科技有限公司）；DNA提取試劑盒（天津博誠科技有限公司）；小鼠胰脂肪酶酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（EEL-M2448c，武漢伊萊瑞特生物科技公司）；胰蛋白酶測定試劑盒（紫外比色法，A080-2，南京建成生物工程研究所）；小鼠膽囊收縮素ELISA試劑盒（CSB-E08115m，武漢華美生物工程有限公司）；三溴乙醇（T48402）、DMBA（D3254）均購自美國Sigma-Aldrich公司；Pierce BCA蛋白定量試劑盒（23225，Thermo Fisher Scientific，美國）；ABC免疫組織化學染色試劑盒（PK-6200，Vector laboratories，美國）；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（DA1015）、EGCG（E8120）、中性樹膠（G8590）、EDTA抗原修復液（50×）pH8.0（C1034）均購自北京索萊寶科技有限公司；增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（AB92552，Abcam，英國）；Co60大小鼠維持飼料（SPF-F02-002，斯貝福北京生物技術(shù)有限公司），含粗蛋白18%，粗脂肪4%；組織勻漿機（Tissue Master 125，OMNI International，美國）；酶標儀（ST360，上海科華實驗系統(tǒng)有限公司）；Thermo ScientificTMNano Drop 2000分光光度計；紫外分光光度計（Gene Quant 1300，Biochrom，英國）；正置顯微鏡（DM4000B）、組織脫水機（ASP200S）、石蠟切片機（RM2235）、組織包埋機（EG1150H+C）、攤 片機（H1210）、烤片機（H1220）、Leica 819一次性窄刀片（14035838925）均購自德國Leica公司；改良Lillie-Mayer蘇木素染色液（DH0001）、伊紅染色液（DH0044）均購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.2動物實驗（1）生理研究。采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為0 g/L STI組（n=11）、2 g/L STI組（n=11）、4 g/L STI組（n=10）、8 g/L STI組（n=11），分別給予含0、2、4和8 g/L STI的飲水。經(jīng)STI干預2周后，小鼠禁食18 h，從內(nèi)眥采集血液至含EDTA二鉀的抗凝管中，離心（1 500×g，15 min，4℃）獲取血漿。小鼠采用頸椎脫位法處死，剖開腹腔，切除胰腺，記錄胰腺濕質(zhì)量。將胰腺分為兩部分，一部分置于4%多聚甲醛中固定，另一部分于-80℃保存，用于后續(xù)檢測。（2）癌發(fā)生研究。采用隨機數(shù)字表法將剩余小鼠分為正常對照組、DMBA包埋組、DMBA+2 g/L STI組、DMBA+8 g/L STI組、DMBA+8 g/L STI+EGCG組，每組3只。將0.05 mg DMBA超聲后混懸于10 μL生理鹽水中，得到DMBA混懸液。小鼠禁食16 h后，腹腔注射2，2，2-三溴乙醇（0.3 mg/g）麻醉。在加熱墊上經(jīng)剃毛和腹部皮膚消毒后，打開腹腔暴露脾，用鑷子輕拉出胰腺尾部，用注射器將10 μL DMBA混懸液注射入胰腺，用棉棒輕壓注射口防止液體滲出，使用連續(xù)縫合逐層關(guān)閉壁層腹膜和骨骼肌，間斷縫合皮膚創(chuàng)面。小鼠術(shù)后禁食24 h，術(shù)后4 h皮下注射0.6 mL生理鹽水（含10%葡萄糖）。STI處理組于DMBA包埋1周后進行STI處理。DMBA+8 g/L STI+EGCG組每天腹腔注射EGCG（25 mg/kg，生理鹽水溶解）。DMBA包埋6周后處死小鼠，將胰腺置于4%多聚甲醛固定后進行組織學分析。

1.3檢測方法

1.3.1血漿CCK水平檢測將標準品和血漿樣品移入ELISA板孔中，37℃孵育2 h，傾去不洗，將生物素偶聯(lián)抗體添加到孔中，孵育后PBS清洗3次，每次3 min，加入辣根過氧化物酶標記的親和素孵育，洗滌去除未結(jié)合的親和素酶試劑，添加底物溶液，37℃水浴箱中孵育20 min，加入終止液，使用酶標儀在450 nm波長處測量吸光度（A）值，最后通過標準曲線計算CCK水平。

1.3.2胰腺組織中蛋白質(zhì)含量測定將胰腺組織用PBS清洗，將含1%PMSF的RIPA裂解液與之混合后在冰上用組織勻漿器勻漿，離心（10 000 r/min，15 min，4℃）后將上清液和牛血清白蛋白標準品加入96孔板中，每孔10 μL，將試劑盒中的A液與B液按照50∶1的比例配成工作液，每孔加100 μL，放入37℃水浴箱中，孵育30 min顯色，在波長為570 nm處用酶標儀讀取A值，根據(jù)標準曲線公式計算胰腺組織中的蛋白質(zhì)含量。

1.3.3胰腺組織中DNA含量測定冰浴下研碎胰腺組織，精確稱量后與試劑盒中的裂解液混合，按照說明書經(jīng)過離心等操作后最終出現(xiàn)白色沉淀，使用無水乙醇清洗后干燥得到組織中的DNA，將其溶解于一定體積的雙蒸水中，用Thermo ScientificTMNanoDrop 2000分光光度計測定DNA濃度，計算胰腺組織中的DNA含量。

1.3.4胰腺組織中胰蛋白酶含量測定精確稱量胰腺組織并加入9倍體積的勻漿介質(zhì)，冰浴條件下機械勻漿，離心（2 500 r/min，10 min，4℃）后取上清液。上清液與底物混合后放入37℃水浴箱中孵育并計時，在30 s時倒入石英比色皿中，于253 nm處使用紫外分光光度計讀取吸光度（A）1值后放回水浴中，并在20 min后再次讀取A2值，計算兩次差值ΔA=A2-A1，根據(jù)胰腺組織的質(zhì)量和ΔA值計算胰蛋白酶量。

1.3.5胰脂肪酶含量測定凍存的胰腺組織稱質(zhì)量后，按照1∶9的比例加入PBS在冰浴中制成勻漿，將樣品和標準品中加入板中37℃孵育1.5 h，甩盡孔內(nèi)液體，不洗。每個孔中加入生物素化抗體工作液100 μL，酶標板加覆膜，37℃溫育1h，甩盡孔內(nèi)液體。每孔加洗滌液350 μL，浸泡1 min傾去，洗滌3次。每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL后37℃溫育30 min，洗滌后，加入顯色底物，觀察到反應呈現(xiàn)藍色后，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450 nm波長處測量A值，通過繪制標準曲線計算樣品的濃度。

1.3.6胰腺免疫組織化學染色采用免疫組織化學染色檢測胰腺組織PCNA陽性細胞百分比。小鼠胰腺經(jīng)過4%多聚甲醛溶液固定和石蠟包埋后切為4 μm厚切片，切片于二甲苯脫蠟后梯度乙醇脫水。使用EDTA緩沖液微波15 min抗原修復，自然冷卻后用PBS漂洗3次，每次5 min，隨后置于濕盒內(nèi)滴加3%過氧化氫溶液孵育20 min。洗滌后，使用馬血清室溫下封閉2 h，傾去不洗，滴加PCNA抗體（1∶200）置于4℃孵育過夜。次日復溫30 min后再洗滌，滴加試劑盒中提供的生物素標記的馬抗兔抗體，常溫孵育30 min。洗滌后加入辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液孵育15 min。洗滌后滴加DAB顯色液顯色2～3 min，浸入自來水中止顯色。蘇木素復染、脫水、透明，中性樹膠封片，鏡下觀察PCNA表達情況。每組隨機讀取15個視野進行檢查，并統(tǒng)計陽性細胞所占總細胞數(shù)比例。

1.3.7胰腺組織HE染色癌發(fā)生實驗的胰腺組織行HE染色后進行病理學診斷。組織制成4 μm切片，37℃恒溫烘烤24 h。切片放入二甲苯中脫蠟10 min；經(jīng)無水乙醇脫水10min，雙蒸水洗后入蘇木素染核2 min，經(jīng)鹽酸乙醇分色后水洗再入氨水藍化，入伊紅染液2 min；經(jīng)乙醇脫水；二甲苯透明封片后光學顯微鏡下觀察，參照PanIN分級標準進行病理學診斷。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠循環(huán)中CCK水平及胰腺濕質(zhì)量2 g/L STI組CCK水平高于0 g/L STI組（P＜0.05），4 g/L STI組CCK水平與0、2 g/L STI組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），8 g/L STI組CCK水平均高于0、2和4 g/L STI組（P＜0.05）。2、4 g/L STI組胰腺濕質(zhì)量高于0 g/L STI組（P＜0.05）；4 g/L STI組胰腺濕質(zhì)量與2 g/L STI組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；8 g/L STI組胰腺濕質(zhì)量高于0、2 g/L STI組（P＜0.05），與4 g/L STI組差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

Tab.1 Comparison of CCK concentration and pancreatic wet mass of mice between the four groups表1各組小鼠CCK水平及胰腺濕質(zhì)量比較（±s）

Tab.1 Comparison of CCK concentration and pancreatic wet mass of mice between the four groups表1各組小鼠CCK水平及胰腺濕質(zhì)量比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與0 g/L STI組比較，b與2 g/L STI組比較，c與4 g/L STI組比較，P＜0.05。

組別0 g/L STI組2 g/L STI組4 g/L STI組8 g/L STI組F n 11 11 10 11 CCK（ng/L）57.33±15.23 79.08±13.13a 67.06±9.62 92.84±9.25abc 17.512＊＊胰腺濕質(zhì)量（mg）152.64±17.74 185.73±31.92a 198.80±29.02a 220.45±43.66ab 8.619＊＊

2.2 小鼠胰腺蛋白質(zhì)和DNA含量比較2、4 g/L STI組蛋白質(zhì)和DNA含量高于0 g/L STI組（P＜0.05），4 g/L STI組蛋白質(zhì)和DNA含量與2 g/L STI組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），8 g/L STI組蛋白質(zhì)和DNA含 量 高 于0、2和4 g/L STI組（P＜0.05）。見表2。

2.3 小鼠胰腺中消化酶含量0、2、4和8 g/L STI組胰蛋白酶含量依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2、4、8 g/L STI組胰脂酶含量高于0 g/L STI組（P＜0.05），2、4、8 g/L STI組胰脂酶含量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

Tab.2 Comparison of protein and DNA content in pancreas of mice between the four groups表2各組小鼠胰腺蛋白質(zhì)和DNA含量比較（±s）

Tab.2 Comparison of protein and DNA content in pancreas of mice between the four groups表2各組小鼠胰腺蛋白質(zhì)和DNA含量比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與0 g/L STI組比較，b與2 g/L STI組比較，c與4 g/L STI組比較，P＜0.05。

組別0 g/L STI組2 g/L STI組4 g/L STI組8 g/L STI組F n 11 11 10 11蛋白質(zhì)含量（mg）14.30±2.37 19.70±4.72a 20.63±4.49a 25.85±5.68abc 12.252＊＊DNA含量（μg）228.29±27.03 281.87±35.36a 299.26±34.12a 346.62±32.88abc 24.892＊＊

Tab.3 Comparison of digestive enzymes of pancreatic tissue of mice between the four groups表3各組小鼠胰腺組織中消化酶含量比較（±s）

Tab.3 Comparison of digestive enzymes of pancreatic tissue of mice between the four groups表3各組小鼠胰腺組織中消化酶含量比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與0 g/L STI組比較，b與2 g/L STI組比較，c與4 g/L STI組比較，P＜0.05。

組別0 g/L STI組2 g/L STI組4 g/L STI組8 g/L STI組F n 11 11 10 11胰蛋白酶含量（U/mg）5.53±0.62 6.86±0.57a 7.98±0.57ab 9.74±0.88abc 76.520＊＊胰脂酶含量（ng/g）325.89±63.38 435.03±35.89a 468.73±82.43a 469.35±96.56a 9.391＊＊

2.4 小鼠胰腺組織中PCNA陽性細胞結(jié)果0、2、4、8 g/L STI組小鼠胰腺組織PCNA陽性細胞比例依次升高，分別為1.93%±1.75%、3.60%±1.40%、5.00%±2.14%、6.60%±2.06%，差 異 有 統(tǒng) 計 學 意 義（F=17.120，P＜0.05），見圖1。

2.5 CCK和EGCG對胰腺癌發(fā)生的作用與正常對照組相比，DMBA包埋組出現(xiàn)胰腺導管的細胞核擁擠和排列紊亂現(xiàn)象，在DMBA+2 g/L STI組中加重且出現(xiàn)核深染。DMBA+8 g/L STI組還出現(xiàn)了由間變細胞組成的條索狀病灶。在DMBA+8 g/L STI+EGCG組中癌前病損的程度有所減輕，見圖2。

3 討論

Fig.1 Results of immunohistochemical staining of PCNA in pancreas(scale=25 μm)圖1小鼠胰腺組織PCNA免疫組織化學染色結(jié)果（比例尺=25 μm）

Fig.2 Effects of CCK and EGCG on neoplastic lesion in mouse pancreas embedded with DMBA(scale=25 μm)圖2 CCK和EGCG對胰腺包埋DMBA小鼠癌發(fā)生的作用（比例尺=25 μm）

胰腺是人體的重要消化腺，分為內(nèi)外分泌腺兩大部分，其中外分泌腺可以分泌胰液。胰液內(nèi)含有各種消化酶，胰酶分泌是促進營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的重要步驟，胰蛋白酶和胰脂酶是胰酶的重要組成成分［6］。胃腸激素CCK可調(diào)節(jié)機體的消化和吸收過程，刺激胰腺消化酶的生成和分泌，并刺激胰腺生長，也可參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展［1］。STI是一種大豆蛋白且具有胰蛋白酶抑制活性，可使I細胞的CCK分泌不再受到抑制，從而提升循環(huán)中CCK水平［3］。既往有關(guān)CCK的研究多將血CCK升高到某單一水平，而不同程度高CCK血癥是否對靶器官有不同的效應尚未明確。

本實驗分別給予小鼠含不同質(zhì)量濃度（0、2、4和8 g/L）的STI，在其體內(nèi)誘導不同程度CCK水平，結(jié)果顯示：（1）2、4 g/L STI組胰腺濕質(zhì)量高于0 g/L STI組，8 g/L STI組胰腺濕質(zhì)量高于0、2 g/L STI組。（2）2、4 g/L STI組胰腺蛋白質(zhì)含量和DNA含量高于0 g/L STI組，8 g/L STI組蛋白質(zhì)含量和DNA含量高于0、2和4 g/L STI組。（3）0、2、4和8 g/L STI組胰蛋白酶含量依次升高；2、4、8 g/L STI組胰脂酶含量高于0 g/L STI組。以上結(jié)果提示循環(huán)中CCK水平不同可導致胰腺不同程度增生，胰酶生成。此法因制備簡單，且CCK水平可控，較通過手術(shù)方式將攜帶膽胰總管的十二指腸轉(zhuǎn)移到遠端小腸的高CCK血癥模型即胰膽轉(zhuǎn)流術(shù)（pancreatobiliary diversion，PBD）更有前景［7］。

PCNA是反映細胞增殖狀態(tài)的指標，因其只存在于正常增殖細胞及腫瘤細胞內(nèi)而得名。本研究結(jié)果顯示，0、2、4、8 g/L STI組小鼠胰腺組織PCNA陽性細胞比例依次升高；此結(jié)果與CCK循環(huán)水平、胰腺濕質(zhì)量和胰腺內(nèi)DNA含量的結(jié)果基本一致，進一步證實胰腺在受到CCK刺激后發(fā)生了增生。

近年來，中國胰腺癌發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢，且在男性和老年人群中尤為明顯；胰腺癌早期缺乏特異癥狀，確診時多已不能手術(shù)治愈，加之對放化療不敏感，中位生存期多不足半年［8-9］。目前有關(guān)CCK刺激胰腺癌發(fā)生的機制尚未明確。CCK受體（cholecystokinin receptor，CCKR）屬G蛋白偶聯(lián)受體，胰島素受體（insulin receptor，IR）屬受體酪氨酸激酶家族（receptor tyrosine kinase，RTK），這兩種受體在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了重要作用［10-11］。EGCG是茶葉中的主要兒茶素，約占59%。EGCG作為綠茶中的有效成分，具有抗炎、抗菌和抗氧化等多種作用。因EGCG具有IR拮抗劑的作用［12］，其抗癌作用越來越受到關(guān)注［5，10］。本研究結(jié)果顯示，隨著CCK水平增高，胰腺組織的癌前病變程度有加重趨勢，而EGCG可減輕高CCK血癥誘導的胰腺癌前病變的程度，其原因可能與CCKR與IR的信號傳導間存在偶聯(lián)有關(guān)，但此種偶聯(lián)關(guān)系尚未明確，闡明此偶聯(lián)關(guān)系可能會對胰腺癌的防治有重要意義。

綜上所述，不同劑量STI能誘發(fā)不同程度的高CCK血癥，CCK可刺激胰腺增生、胰酶生成及胰腺癌的發(fā)生，而EGCG具有減輕胰腺癌前病變的作用。