2型糖尿病腎病患者血清miR-27b-3p、miR-342-3p表達特點及臨床意義

韓敬，顧津伊，聶君旭，張艷萍，趙玲華

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病較嚴重和致命的并發癥之一。DN早期以腎臟肥大為主要病理特征，隨著病情進展，其可導致腎小球細胞外基質沉積和腎小管間質纖維化，最終發展為不可逆腎結構性損傷，引起終末期腎病［1］。2009—2012年我國2型糖尿病患者中DN的患病率為30%～50%，已超越腎小球腎病成為我國慢性腎病的首要原因［2-4］。DN早期癥狀隱匿，若不及時發現往往延誤治療時機，探尋DN相關生物標志物，早期發現、早期干預是改善患者預后的關鍵［5］。腎纖維化是腎臟功能衰退的主要病理基礎，過度炎癥反應可促使成纖維細胞增殖和過量基質蛋白積累，導致腎功能進行性下降，最終引發腎功能衰竭［6］。微小RNA（miRNAs）是一種單鏈非編碼RNA，通過抑制或降解mRNA，從而調節其靶基因的表達，miRNAs已被證實在腎纖維化的發展中起重要作用［7］。有研究顯示，在心房顫動大鼠模型中，通過誘導miR-27b-3p過表達，可靶向抑制Wnt3a表達，繼而抑制Wnt/β-Catenin信號通路，抑制心肌細胞纖維化［8］。生物信息學分析表明，miR-342-3p在DN中表達下調，可能參與腎小管上皮細胞凋亡、腎間質細胞外基質的累積和纖維化進程［9］。目前，miR-27b-3p、miR-342-3p是否與DN有關尚不明確。本研究旨在探討DN患者血清miR-27b-3p、miR-342-3p表達水平與DN的關系，以期為相關研究提供參考。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇2018年1月—2021年12月云南大學附屬醫院收治的2型糖尿病患者157例，診斷符合2017版《中國2型糖尿病防治指南》。排除標準：原發性腎臟疾病、腎先天畸形；伴惡性腫瘤、自身免疫疾病及急慢性感染性疾病；伴肺纖維化、肝纖維化、縱隔纖維化等纖維化疾病。根據患者尿白蛋白與肌酐比率（UACR）［10］將患者分為正常白蛋白尿（UACR＜30 mg/g，NA）組49例、微量白蛋白尿（30 mg/g≤UACR＜299 mg/g，MA）組41例、大量白蛋白尿（UACR≥300 mg/g，DN）組67例。3組年齡、性別構成及體質量指數（BMI）比較差異無統計學意義，具有可比性，見表1。本研究已經獲得我院倫理委員會批準（倫理號：PZ-180212），患者或家屬均簽署知情同意書。

Tab.1 Comparison of baseline data between the three groups表1 3組基線資料比較

1.2研究方法

1.2.1一般資料收集收集受試者年齡，性別，BMI，吸煙史（煙齡20 a，吸煙量≥20包/a），合并疾病（高血壓、高脂血癥、冠心病、腦梗死），2型糖尿病病程，2型糖尿病家族史，是否合并視網膜病變，是否合并非酒精性脂肪肝，入院時收縮壓和舒張壓，降糖治療用藥情況（口服降糖藥物、胰島素皮下注射、口服降糖和胰島素皮下注射聯合用藥）等。

1.2.2實驗室檢查2型糖尿病患者入院24 h內采集肘正中靜脈血3 mL和尿液完善實驗室常規檢查。采用Spectra-Max?iD5多功能酶標儀（上海美谷分子儀器有限公司）以雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗檢測尿液中Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原肽（PCⅢ）水平，試劑盒購自奧維亞生物技術有限公司。參照劉旭輝等［11］方法采用實時定量聚合酶鏈反應檢測miR-27b-3p、miR-342-3p。引物序列miR-27b-3p：上游5′-AGTGGCTAAGTTCTGCTCTCAAC-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′；miR-342-3p：上游5′-ACACTCCAGCTGGGAGGGGGTGCTATCTGTGAT-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6（內參）：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。東芝40型全自動生化分析儀檢測三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），根據CKD-EPI公式估算腎小球濾過率（eGFR）。放射免疫法（儀器為GC-1200 γ放射免疫計數器）檢測尿微量白蛋白。美國強生穩定倍加型血糖儀檢測末梢血空腹血糖（FPG），放射免疫法（日立h7060全自動化學免疫分析儀）檢測空腹胰島素（FINS）。計算穩態模型評估胰島素抵抗指數（HOMA-IR）=（FPG×FINS）/22.5，HA8160糖化血紅蛋白分析儀檢測糖化血紅蛋白（HbA1c）。

1.3統計學方法采用SPSS 25.00和MedCalc 19.0.4軟件進行數據分析。符合正態分布的計量數據以±s表示，偏態分布經對數轉換后使其符合正態分布，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。計數資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，組間多重比較采用校正χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關。采用多因素Logistic回歸分析危險因素。繪制受試者工作特征（ROC）曲線進行診斷效能分析，采用Delong test檢驗計算曲線下面積差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組一般資料比較3組吸煙史、高脂血癥、冠心病、腦梗死、2型糖尿病家族史、舒張壓、降糖治療比例差異無統計學意義。與NA組比較，DN組和MA組2型糖尿病病程、收縮壓均增加（P＜0.05），DN組高血壓、合并視網膜病變、合并非酒精性脂肪肝比例增加（P＜0.05）。與MA組比較，DN組高血壓、2型糖尿病病程、合并視網膜病變、合并非酒精性脂肪肝比例、收縮壓均增加（P＜0.05），見表2。

2.2 3組實驗室指標比較與NA組比較，MA組和DN組HbA1c、UACR、尿Ⅳ-C、尿LN、尿PCⅢ水平均增加，而miR-27b-3p、miR-342-3p表達均降低（P＜0.05），DN組BUN、Scr水平增加，而eGFR水平降低（P＜0.05）。與MA組比較，DN組HbA1c、BUN、Scr、UACR以及尿Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平均增加，而eGFR和miR-27b-3p、miR-342-3p表 達 均 降 低（P＜0.05），見表3。

2.3 影響DN的Logistic回歸分析結果以是否患DN（否=0，是=1）因變量，以高血壓（否=0，是=1）、2型糖尿病病程、視網膜病變（否=0，是=1）、非酒精性脂肪肝（否=0，是=1）、HbA1c、miR-27b-3p、miR-342-3p、收縮壓、UACR、BUN、Scr、尿Ⅳ-C、尿LN、尿PCⅢ，eGFR為自變量。單因素Logistic回歸結果顯示，高血壓、HbA1c、尿PCⅢ、eGFR、miR-27b-3p、miR-342-3p是DN發生的影響因素（P＜0.05），見表4。將單因素Logistic回歸中差異有統計學意義的變量納入多因素Logistic回歸方程，采用逐步后退法選擇和剔除變量，結果顯示，較高水平的尿PCⅢ是DN的危險因素，而較高水平的miR-27b-3p、miR-342-3p、eGFR是保護因素（P＜0.05），見表5。

2.4 相關性分析DN組miR-27b-3p、miR-342-3p表達與eGFR呈正相關（r分別為0.647、0.661，P＜0.05），與尿PCⅢ呈負相關（r分別為-0.739、-0.766，P＜0.05）。

Tab.2 Comparison of baseline data and laboratory indicators between the three groups表2各組一般資料比較

Tab.3 Comparison of laboratory indicators between the three groups表3各組實驗室指標比較 （±s）

Tab.3 Comparison of laboratory indicators between the three groups表3各組實驗室指標比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與NA組比較，b與MA組比較，P＜0.05。

組別NA組MA組DN組F n 49 41 67 TC（mmol/L）5.19±1.42 5.21±1.53 5.28±1.55 0.276 TG（mmol/L）1.75±0.20 1.76±0.21 1.80±0.25 0.537 LDL-C（mmol/L）3.57±0.55 3.59±0.51 3.62±0.65 0.317 FPG（mmol/L）7.90±1.30 7.93±1.31 8.42±1.35 2.765 FINS（U/mL）8.79±1.83 8.82±1.93 9.05±2.33 1.805 HbA1c（%）5.02±1.21 6.12±1.34a 8.85±1.79ab 77.594＊＊HOMA-IR 3.08±0.59 3.11±0.97 3.39±1.08 2.861 BUN（mmol/L）5.65±1.35 6.12±1.09 35.26±6.32ab 1 044.950＊＊Scr（μmol/L）84.98±16.97 85.35±16.53 186.43±21.52ab 555.002＊＊組別NA組MA組DN組F UACR（mg/g）16.35±3.53 103.47±26.23a 369.02±41.42ab 839.418＊＊eGFR［mL/（min·1.73m2）］113.05±13.42 112.32±13.26 82.35±6.43ab 145.616＊＊Ⅳ-C（μg/L）72.02±12.72 80.12±15.32a 201.32±30.07ab 707.673＊＊LN（μg/L）64.95±13.08 71.50±16.09a 136.26±28.65ab 149.726＊＊PCⅢ（μg/L）44.02±10.27 49.53±11.02a 163.26±21.18ab 921.650＊＊miR-27b-3p（2-ΔΔCt）3.10±0.69 2.29±0.55a 1.02±0.35ab 166.444＊＊miR-342-3p（2-ΔΔCt）2.81±0.52 2.01±0.34 0.95±0.28ab 249.438＊＊

Tab.4 Univariate Logistic regression analysis of factors affecting the incidence of DN表4影響DN的單因素Logistic回歸分析

Tab.5 Multivariate Logistic regression analysis of factors affecting the incidence of DN表5影響DN的多因素Logistic回歸分析

2.5 各指標診斷DN效能分析基于前述Logistic回歸結果，建立聯合診斷回歸預測模型，Log［P/（1-P）］=15.087+0.502×尿PCⅢ-0.842×eGFR-0.559×miR-27b-3p-0.416×miR-342-3p，擬合ROC曲線顯示聯合診斷DN的AUC為0.948，聯合檢測效能高于單獨eGFR、尿PCⅢ、miR-27b-3p、miR-342-3p（Z分別 為5.631、5.794、6.715、4.577，P＜0.05），見 圖1、表6。

Fig.1 ROC graphs of eGFR,PCⅢ,miR-27b-3p and miR-342-3p for diagnosing DN圖1 eGFR、尿PCⅢ、miR-27b-3p、miR-342-3p診斷DN的ROC曲線

Tab.6 Efficacy of eGFR,PCⅢmiR-27b-3p and miR-342-3p in diagnosing DN表6 eGFR、尿PCⅢ、miR-27b-3p、miR-342-3p診斷DN的效能

3 討論

DN是導致糖尿病患者死亡和殘疾的主要原因。目前，DN診斷以UACR、eGFR為主要參考指標，但是UACR、eGFR受感染、發熱、心力衰竭等因素影響較大，積極探尋新型DN相關生物學標志物十分必要。目前，已發現DN患者血清和腎組織中部分miRNA異常表達，miRNA可能與DN發病機制密切相關，有望成為DN早期診斷的潛在標志物［12］。miR-27b-3p是與組織纖維化密切相關的miRNA，位于人類19號染色體，在乳腺、肝臟、腎臟等多種器官中廣泛表達，miR-27b-3p通過靶向轉化生長因子（TGF）-β受體1、Smad等纖維化相關基因表達，從而參與成纖維細胞活化的調節過程，其與多種纖維化相關疾病的發生有關［13］。研究顯示，miR-27b在心肌纖維化患者和大鼠梗死心臟組織中表達水平均增加，miR-27b過表達通過抑制含F框及WD重復結構域蛋白7介導的Snail降解，促使膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和基質金屬蛋白酶-9表達，誘導上皮間質轉化（EMT），促進心肌細胞增殖和纖維化［14］。miR-27b-3p同樣參與視網膜下纖維化進程，miR-27b-3p表達增加可通過靶向調控HOXC6基因，阻斷TGF-β/Smad信號通路激活，抑制EMT和視網膜纖維化［15］。miR-27b-3p還 通 過 直 接 靶 向TGF-β受 體1和SMAD2，抑制肺組織成纖維細胞活化［13］。本研究結果顯示，DN組、MA組患者血清miR-27b-3p表達較NA組下調，且miR-27b-3p表達與eGFR呈正相關，與尿PCⅢ呈負相關，表明miR-27b-3p表達下調可能導致腎纖維化和腎功能損傷，提示miR-27b-3p可抑制腎纖維化和2型糖尿病患者DN進程，機制可能為miR-27b-3p表達下調而導致其抗纖維化作用減弱，促使肌成纖維細胞活化和增殖，腎小管上皮細胞凋亡及上皮細胞表型轉化，導致細胞外基質在腎間質過度積聚，最終導致腎纖維化和DN的發生。體外實驗亦顯示，miR-27b-3p通過結合信號轉導和轉錄激活因子1（STAT1）的3′-UTR并下調STAT1表達，從而抑制α-平滑肌激動蛋白、Ⅲ型膠原蛋白和纖維連接蛋白表達，減輕腎纖維化［16］。

miR-342-3p定位于14q32，嵌入其宿主基因Ena/VASP like（EVL）的第三個內含子中，與細胞外基質沉積和TGF-β信號通路均關系密切［17］。miR-342-3p是Notch信號通路的下游分子，通過抑制內皮細胞中的SMAD1/5磷酸化，從而調節血管內皮生長因子和TGF-β表達，參與血管生成和EMT［18］。另外，miR-342-3p還可負向調控Wnt3a表達，從而參與腫瘤細胞的增殖、凋亡過程以及EMT調控過程［19］。TGF-β是腎纖維化的關鍵介質，主要通過激活其下游Smad信號通路來誘導α-平滑肌激動蛋白、Ⅲ型膠原蛋白和纖連蛋白表達，促進成纖維細胞活化，增強膠原合成和細胞外基質沉積，最終導致腎纖維化形成［20］。EMT是肌成纖維細胞的主要來源，活化肌成纖維細胞可引起細胞外基質沉積，引起腎間質纖維化［21］。由此推測，miR-342-3p可能與腎纖維化和腎臟疾病有關。本研究結果亦顯示，DN組、MA組患者血清miR-342-3p表達較NA組下調，證實了miR-342-3p低表達與腎纖維化和腎功能下降有關。推測miR-342-5p參與DN的機制為：首先，miR-342-5p可通過負向調控Ptch1表達，抑制由TGF-β1誘導的細胞自噬，進而抑制腎纖維化進程［22］；其次，miR-342-3p可靶向抑制SRY盒轉錄因子6表達，促進腎系膜細胞增殖并抑制其凋亡，抑制高糖誘導的腎間質纖維化［23］。因此，miR-342-3p表達下調可能通過促使腎纖維化，從而導致腎功能損傷和DN發生。

miR-27b-3p、miR-342-3p在DN患者血清中的異常表達可用作DN輔助診斷的參考指標。本研究ROC分析結果顯示，miR-27b-3p、miR-342-3p在糖尿病人群中鑒別DN的AUC為0.733、0.652，表明miR-27b-3p、miR-342-3p可鑒別DN的發生，但是單獨診斷敏感度和特異度均偏低，尚不能滿足診斷DN的需求，聯合eGFR、PCⅢ、miR-27b-3p、miR-342-3p指標后AUC明顯擴大，表明聯合miR-27b-3p、miR-342-3p、eGFR、PCⅢ檢測可提高DN的檢出率，為臨床診斷提供更可靠的參考。

綜上，DN、MA患者血清miR-27b-3p、miR-342-3p表達較NA患者均降低，miR-27b-3p、miR-342-3p低表達與腎功能下降、DN發生有關；miR-27b-3p、miR-342-3p表達下調可能通過加速腎纖維化，從而參與DN發病過程。因此，miR-27b-3p、miR-342-3p可作為DN輔助診斷的參考指標。