利用貝萊斯芽孢桿菌提高紅曲米發酵生產中抗黃曲霉污染的能力

李昱涵，付瑞燕

(安徽農業大學 茶與食品科技學院，安徽 合肥，230036)

紅曲米是以秈米等稻米為原料，經紅曲霉發酵后烘干而成的棕紅色至紫紅色的米粒[1]。紅曲中的色素是一種天然色素，安全性高、著色穩定性強，且具有防腐的功效，在中國及周邊國家被廣泛地應用于食品行業中，至今已有一千多年的食用歷史[2]。在生產中，紅曲米的污染問題不容忽視，因為這會影響紅曲的產量和含量。劉春梅等[3]指出紅曲米生產中由菌種本身造成的污染率約為4.31%，由接種操作引起的污染率約為1.76%。分析可能的污染源有車間空氣及環境、接種操作過程帶入雜菌等，因此發酵過程的每一步都要避免雜菌污染的風險。李曉樓[4]提出發酵紅曲米的過程中要加強衛生管理，可加入占種曲質量0.2%的體積分數為99.5%的乙酸來減少黃曲霉毒素和其他雜菌毒素的產生。黃曲霉是自然環境中較為常見的霉菌，其孢子可擴散至空氣中傳播。本課題組發現，用純種紅曲霉發酵制備的紅曲米被黃曲霉污染的機率較高，然而，在用市售紅曲米作為曲種發酵的過程中出現污染黃曲霉的情況并不經常發生。市售紅曲米的生產過程一般較為粗放，并非絕對的無菌環境，這種開放式生產可能給紅曲米的發酵過程引入了某種能抑制黃曲霉的菌種。基于此種推測，課題組擬從市售紅曲米中分離篩選出1株能夠抑制黃曲霉孢子生長且不會影響紅曲霉產色素的菌株，旨在紅曲米發酵中將其作為輔助菌株以提高紅曲米大規模發酵生產過程的魯棒性，即不要求嚴格的無菌操作，也能保證發酵的正常進行。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 市售紅曲米及秈米

市售紅曲米產自福建省古田縣程久紅粬有限公司，秈米(福臨門絲泉米)產自中糧米業(巢湖)有限公司。

1.1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；PHS-3C pH計，上海雷磁儀器有限公司；752紫外可見記錄分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；SPX-150B-Z生化培養箱，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；DHG-9101-1SA電熱恒溫干燥箱，上海三發科學儀器有限公司。

1.1.3 菌株

紫色紅曲霉M9和貝萊斯芽孢桿菌Y5為實驗室研究團隊從市售紅曲米上分離所得。

1.1.4 培養基

紅曲霉培養基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨20，可溶性淀粉30。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)培養基(g/L)：馬鈴薯200(切塊后用水煮沸30 min，紗布過濾，收集濾液)，葡萄糖20。

芽孢桿菌培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏15，NaCl 15。

乳酸菌培養基(g/L)：蛋白胨5，牛肉膏5，酵母浸粉5，葡萄糖20，乳糖20，中性紅0.05，CaCO310。

酵母菌培養基(g/L)：葡萄糖1，酵母浸粉2.5，醋酸鈉8.2，KCl 1.8。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅曲米的制備及色價的測定

稱取30 g秈米，在100 mL pH為3.5的自來水中浸泡10 h，然后將水瀝干，將米裝入250 mL的燒杯中，用6層紗布封口，121 ℃滅菌20 min，滅菌結束后用無菌玻璃棒攪開蒸熟的米粒，待其冷卻至室溫后，接種經2層紗布過濾的紅曲霉M9種子液2 mL，用無菌玻璃棒攪拌均勻，在32 ℃下培養，每隔24 h加1次無菌水并攪拌，前2 d加水量為2 mL，從第3天開始加水量為4 mL。紅曲米發酵10 d后，將紅曲米置于60 ℃的恒溫干燥箱中進行烘干，之后將紅曲米粉碎并過60目篩，收集紅曲米粉，測定其色價。根據GB 1886.19—2015《食品安全國家標準 食品添加劑 紅曲米》中的方法提取紅曲米粉中的色素并進行其色價的測定。

1.2.2 市售紅曲米中優勢菌株的分離純化

稱取10 g以市售紅曲米為曲種所制備的紅曲米，將其置于帶有玻璃珠的90 mL無菌生理鹽水中，在180 r/min下振蕩30 min，取上清液進行梯度稀釋，涂布在各分離培養基平板上，32 ℃下培養2～5 d，經劃線分離獲得純種。

1.2.3 污染紅曲米的黃曲霉菌株的分離純化及其鑒定

挑取紅曲米發酵過程中污染雜菌的黃綠色米粒，置于PDA平板上進行培養，用劃線法和稀釋平板法將污染菌分離純化。采用形態學觀察與分子生物學鑒定相結合的方式，確定該菌株的微生物學地位。

1.2.4 市售紅曲米中具有抗黃曲霉污染能力的菌株的篩選

1.2.4.1 菌種準備

紅曲霉M9孢子液按6%的接種量接入紅曲霉培養基中，32 ℃下150 r/min振蕩培養5 d，經2層紗布過濾，制備濃度為1×104個/mL的孢子液備用，以下簡稱為M9。

將黃曲霉LQ菌株孢子液在PDA平板上劃線接種，32 ℃下培養3 d后，用生理鹽水沖洗平板上的孢子，制備濃度為10個/mL的孢子液備用，以下簡稱為LQ。

從市售紅曲米中分離純化出的17個待篩菌株以2%的接種量接入相應的培養基，在32 ℃下振蕩培養18 h后，取發酵液在8 000 r/min下離心5 min，收集菌體，用生理鹽水重懸后，將菌懸液稀釋20倍備用。

1.2.4.2 黃曲霉LQ菌株孢子液添加量對紅曲米發酵的影響

按1.2.1所述方法制備紅曲米，在冷卻至室溫的滅菌米粒中按以下方案加入如前所述制備的紅曲霉M9孢子液和黃曲霉LQ孢子液。實驗組在米中加入3 mL菌液，菌液的組成為M9孢子液∶LQ孢子液∶生理鹽水，其體積比依次為1∶1∶1、3∶1∶1、5∶1∶1、7∶1∶1、9∶1∶1，依次標記為A、B、C、D、E，對照組在米中所加入的3 mL菌液組成為1mL M9孢子液+2 mL生理鹽水，分別將以上制備好的實驗組和對照組的3 mL菌液混勻后取2 mL加入米中。

1.2.4.3 具有抗黃曲霉污染能力的菌株的篩選

在冷卻至室溫的滅菌米粒中按以下方案加入如前所述制備的菌液。實驗組為紅曲霉M9+黃曲霉LQ+X菌株(17個待篩菌株中的1種)這3種菌液各1 mL，混勻后取2 mL菌液接種在秈米上；對照組為這3種菌液與生理鹽水的不同組合，均為混勻后取2 mL 菌液接種在秈米上，對照組(1)為1 mL M9+2 mL生理鹽水，對照組(2)為1 mL LQ+2 mL生理鹽水，對照組(3)為1 mL LQ+1 mL M9+1 mL生理鹽水，對照組(4)為1 mL M9+1 mL X菌株菌液+1 mL生理鹽水。

1.2.4.4 輔助菌株的確定及其鑒定

在冷卻至室溫的滅菌米粒中按以下方案加入如前所述制備的菌液。實驗組為1 mL M9 +1 mL LQ +1 mL X菌株菌液，混勻后取2 mL菌液接種在秈米上，對照組為1 mL M9 +2 mL生理鹽水。選取所制備紅曲米色價最高的實驗組中所用的待篩菌株作為輔助菌株。采用形態學觀察與分子生物學鑒定相結合的方式，確定該菌株的微生物學地位。

1.2.5 貝萊斯芽孢桿菌Y5提高紅曲米發酵過程抗污染能力的工藝優化

1.2.5.1 貝萊斯芽孢桿菌Y5的接種時間對紅曲米發酵的影響

在冷卻至室溫的滅菌米粒中按以下方案加入如前所述制備的菌液。實驗組為添加體積比為1∶1∶1的紅曲霉M9孢子液、黃曲霉LQ孢子液、與M9接種時間間隔0、1、2、3 d的貝萊斯芽孢桿菌Y5菌液。對照組分別為1 mL M9 +2 mL生理鹽水和1 mL M9+1 mL LQ +1 mL生理鹽水，每組菌液的總加入量為2 mL。

1.2.5.2 貝萊斯芽孢桿菌Y5的接種量對紅曲米發酵的影響

在冷卻至室溫的滅菌米粒中按以下方案加入如前所述制備的菌液。實驗組為添加體積比為1∶1∶1的紅曲霉M9孢子液、黃曲霉LQ孢子液、稀釋10、20、30、40倍的貝萊斯芽孢桿菌Y5菌液，M9和LQ接種后1 d接入Y5菌株菌液。對照組分別為1 mL M9 +2 mL生理鹽水和1 mL M9 +1 mL LQ +1 mL生理鹽水，每組菌液的總加入量為2 mL。

1.2.5.3 紅曲霉M9和貝萊斯芽孢桿菌Y5的混菌比例對紅曲米發酵的影響

在冷卻至室溫的滅菌米粒中按以下方案加入如前所述制備的菌液。實驗組為紅曲霉M9孢子液∶稀釋20倍的貝萊斯芽孢桿菌Y5的菌液體積比依次為1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、10∶1，M9和LQ接種后1 d接入Y5菌液，對照組為1 mL M9 +2 mL生理鹽水，每組菌液的總加入量為2 mL。

1.2.6 貝萊斯芽孢桿菌Y5提高紅曲米發酵過程抗污染能力的驗證實驗

待滅菌米粒冷卻至室溫后，在粗放條件下(即不在無菌條件下)加入如前所述制備的1 mL紅曲霉M9孢子液+1 mL生理鹽水，間隔1 d后加入1 mL稀釋20倍的貝萊斯芽孢桿菌Y5菌液，對照組為1 mL M9+2 mL 生理鹽水，持續觀察各批次中實驗組與對照組發酵過程中的染菌情況，共進行10個批次的紅曲米發酵驗證實驗，計算染菌率。

1.2.7 數據處理

所有試驗均為3次重復，實驗結果使用SPSS軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 市售紅曲米中優勢菌株的分離純化

將市售紅曲米作為曲種發酵紅曲米，取發酵至第11天的紅曲米，利用乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌培養基，采用稀釋平板法與三區劃線法相結合分離純化，最終得到17株菌。

2.2 污染紅曲米的黃曲霉菌株的分離純化及其鑒定

如圖1所示，圖1-a為從紅曲米上分離純化出來的污染菌LQ菌株在平板上生長的形態，可見呈黃綠色的孢子粉密集，圖1-b為其顯微形態，可見菌絲有分隔、較短且為疏松的放射狀，具有長而粗糙的分生孢子梗，頂端具有近球形的頂囊。

a-菌落形態；b-顯微形態圖1 菌株LQ菌落形態和顯微形態Fig.1 Colony morphology and micromorphology of strain LQ

菌株LQ采用真菌ITS序列鑒定，使用Sanger測序，將所得序列用NCBI上BLAST軟件進行比對，鑒定結果表明污染紅曲米的菌株LQ與黃曲霉(Aspergillusflavus)的相似度為99.8%，結合形態學特征觀察的結果，菌株LQ被鑒定為黃曲霉。

2.3 市售紅曲米中具有抗黃曲霉污染能力的菌株的篩選

2.3.1 黃曲霉LQ菌株孢子液添加量對紅曲米發酵的影響

為尋找合適的黃曲霉LQ孢子液在紅曲米種子液中的添加量，本實驗探究了黃曲霉LQ孢子液添加量對紅曲米發酵的影響，如圖2所示，發酵第3天，A組[V(紅曲霉M9)∶V(黃曲霉LQ)∶V(生理鹽水)=1∶1∶1]米粒表面長出的白色菌絲、黃綠色孢子的米所占的比例最大，紅色米粒的比例最少，表明黃曲霉的此種污染程度使得在紅曲米發酵初期已明顯阻礙了紅曲霉M9在秈米上的生長，而E組[V(紅曲霉M9)∶V(黃曲霉LQ)∶V(生理鹽水)=1∶1∶1]米粒上已無明顯的黃曲霉的生長，其發酵程度與紅曲霉M9單菌發酵的對照組的近似。故在后續實驗中，在2 mL 的種子液中定量加入2/3 mL的黃曲霉LQ孢子液。

2.3.2 市售紅曲米中具有抗黃曲霉污染能力的菌株篩選

前面從市售紅曲米中共分離得到17株菌株，為從中篩選到具有抗黃曲霉污染能力的菌株，設置了4組對照組，若對照組(1)中紅曲霉M9生長正常，對照組(2)中黃曲霉LQ生長正常，對照組(3)中黃曲霉LQ的生長阻礙紅曲霉M9的生長，對照組(4)中X菌的加入未使紅曲霉M9的發酵受到明顯抑制，并且實驗組中因為X菌的加入使得黃曲霉LQ的生長受到抑制，則表明X菌株具有抗黃曲霉污染能力。結果表明，這17株菌中的Y5、J5和J6菌株具有抗黃曲霉污染能力，可以完全抑制黃曲霉產孢，直至發酵結束秈米中都不會出現明顯的黃曲霉污染。

圖2 黃曲霉LQ孢子液在秈米中的加入量對紅曲米發酵的影響Fig.2 Effect of addition of A.flavus LQ spore suspension into indica rice on the fermentation of red fermented rice

2.3.3 輔助菌株的確定及其鑒定

在黃曲霉LQ孢子液加入量為2/3 mL的條件下，分別將Y5、J5和J6菌株與紅曲霉M9進行混菌發酵。實驗顯示，與對照組相比，3株待選菌雖然均可抑制黃曲霉的污染，但與紅曲霉M9的混菌發酵所制得的紅曲米色價均較低，其中Y5菌的加入所導致的紅曲米色價降幅為38.7%，而J5和J6菌株與紅曲霉M9混菌發酵制備的紅曲米色價比對照組分別降低了62.1%和62.3%，故確定Y5菌株為輔助菌株。

Y5菌株的菌落形態和顯微形態如圖3所示。將菌株Y5的16S rDNA序列使用Sanger測序，將所得序列用NCBI上BLAST軟件進行比對，結果表明Y5菌株與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)菌株的序列相似度達99%，結合其形態學特征觀察結果，鑒定其為貝萊斯芽孢桿菌。

a-菌落形態；b-顯微形態圖3 Y5菌株的菌落形態和顯微形態Fig.3 Colony morphology and micromorphology of strain Y5

以上實驗表明貝萊斯芽孢桿菌Y5菌可有效地抑制黃曲霉LQ的生長，但其加入也會明顯降低紅曲米的色價。為此，后續實驗嘗試通過優化混菌工藝條件，以降低Y5菌株對紅曲米發酵帶來的不利影響。

2.4 貝萊斯芽孢桿菌Y5提高紅曲米發酵過程抗污染能力的工藝優化

2.4.1 貝萊斯芽孢桿菌Y5菌株的接種時間對紅曲米發酵的影響

貝萊斯芽孢桿菌Y5菌株是細菌，生長速度快于屬于真菌的紅曲霉M9，從前述實驗結果可知，當Y5菌株與M9菌株同時接入秈米時，會阻礙紅曲米的正常發酵，為此通過延后Y5菌株的接種時間，以期在紅曲米不被黃曲霉污染的前提下，不影響M9菌株的正常生長，從而提高紅曲米的色價。

在黃曲霉LQ孢子液加入量為2/3 mL的條件下，將Y5與M9菌株進行混菌發酵。結果顯示，在M9菌株接種1 d后(間隔1 d)接種Y5菌株，所制備的紅曲米色價為(2 026.0±5.3)U/g，該色價雖然低于對照組色價[(2 556.4±10.8)U/g]，但顯著高于間隔0 d加入菌株Y5所制得的紅曲米色價[(1 642.1±7.2)U/g]，尤其值得注意的是間隔2 d及以上再加入Y5菌株則無法抑制黃曲霉LQ生長，從而導致紅曲米無法繼續正常發酵(紅曲米色價為0)，故Y5菌株的接種時間確定為間隔1 d加入。

2.4.2 貝萊斯芽孢桿菌Y5接種量對紅曲米發酵的影響

貝萊斯芽孢桿菌Y5作為輔助菌株，其接種量過大將不利于主發酵菌紅曲霉M9的生長，但接種量過小也不利于其發揮抑制黃曲霉LQ污染的作用，為此本實驗探索了Y5菌株的菌液濃度對紅曲米混菌發酵的影響。在黃曲霉LQ孢子液加入量為2/3 mL的條件下，將Y5與M9菌株進行混菌發酵，如圖4所示，當Y5菌株的菌液稀釋20倍，即菌液濁度(OD560)為0.19時，發酵所制備的紅曲米色價最高，故Y5菌株接種量確定為稀釋20倍的Y5菌株菌液。

圖4 貝萊斯芽孢桿菌Y5接種量對紅曲米色價的影響Fig.4 Effect of inoculation volume of B.velezensis Y5 on the pigment value of red fermented rice注：圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4.3 紅曲霉M9和貝萊斯芽孢桿菌Y5的混菌比例對紅曲米發酵的影響

紅曲霉M9的生長可提高色價，但黃曲霉污染會嚴重抑制其生長；貝萊斯芽孢桿菌Y5不能產色素，但其可抑制一定濃度的黃曲霉LQ孢子在秈米中的生長。為了在黃曲霉孢子存在條件下盡可能地提高紅曲米色價，本實驗優化了M9菌株和Y5菌株的混菌比例。如圖5所示，當M9∶Y5混菌比例為8∶1時，紅曲米色價[(2 091±15.5)U/g]超過了M9單菌發酵組[(2 029.5±15.5)U/g]，因此紅曲霉M9和芽孢桿菌Y5的混菌比例確定為8∶1。

圖5 紅曲霉M9和貝萊斯芽孢桿菌Y5的混菌比例對 紅曲米色價的影響Fig.5 Effect of the proportion of A.purpureus M9 and B.velezensis Y5 on the pigment value of red fermented rice

2.5 貝萊斯芽孢桿菌Y5提高紅曲米發酵過程抗污染能力的驗證性實驗

在10個批次粗放條件下的紅曲米發酵過程中，紅曲霉M9與貝萊斯芽孢桿菌Y5的混菌實驗組均未出現染菌情況，而紅曲霉M9單菌發酵組有2個批次出現染菌，結果如圖6所示。

a-粗放條件下紅曲霉M9單菌發酵秈米第3天米粒被污染的情況； b-粗放條件下紅曲霉M9單菌發酵秈米第6天米粒被污染的情況圖6 粗放條件下紅曲霉M9單菌發酵秈米第3天和 第6天米粒被污染的情況Fig.6 Contamination situation of indica rice fermented for 3 d and 6 d which was inoculated only with A.purpureus M9 under extensive conditions

被污染的一批紅曲霉M9單菌發酵組在發酵第3天米粒上即出現明顯的白色菌絲(圖6-a)，在發酵第7天米粒上出現明顯的黃綠色霉菌孢子(圖6-b)。實驗表明，Y5菌株的加入能夠有效抑制粗放條件下紅曲米發酵過程中污染黃曲霉LQ。因此，可以推測，應用本工藝在大規模發酵生產中不需要嚴格的無菌操作，也能保證紅曲米發酵的正常進行。

3 結論與討論

實驗表明，在紅曲霉M9菌株接種秈米1 d后以8∶1的比例接種稀釋20倍的貝萊斯芽孢桿菌Y5菌液，該混菌工藝可在一定量黃曲霉LQ孢子存在情況下，使紅曲米的發酵過程不被污染，且紅曲米的色價略高于紅曲霉M9單菌發酵的紅曲米色價。

紅曲米現代制法是以稻米為基質接入紅曲霉菌種發酵制成，雖然可控性更強，但極大地限制了有益微生物對紅曲米發酵過程的協同作用。黃曲霉與紅曲霉同為曲霉屬真菌，對營養物質和生長條件的需求與紅曲霉有相似之處，且生長速度比紅曲霉更快，孢子粉量大且易在空氣中傳播，一旦污染正在發酵的紅曲米，則會阻礙紅曲米的正常發酵。紅曲米傳統的制法是自然培菌、開放式發酵，環境中的微生物在稻米基料上競爭性生長繁殖，優勝劣汰，因此，本研究采用“道法自然”的思路來解決紅曲米發酵污染的問題。芽孢桿菌作為微生物拮抗劑，應用于植物上防病治病的研究較多[5-8]，但是應用于紅曲米的發酵過程以抑制霉菌污染卻未見報道。貝萊斯芽孢桿菌在抑制微生物病原生長的同時可促進植物生長而被廣泛應用于農業生防[9-10]，近年來，也有少數研究將貝萊斯芽孢桿菌用于飼料、食品發酵[11-13]。本課題組首次從紅曲米中分離出1株貝萊斯芽孢桿菌，在發酵前期微量接種該菌株可在黃曲霉孢子存在條件下使紅曲米的發酵過程不被污染，可見，紅曲米傳統制法是有其獨特之處的，紅曲米的發酵不能僅依靠紅曲霉單菌，其他菌種的存在對發酵的順利進行是有著重要的輔助作用的。并且紅曲霉M9與貝萊斯芽孢桿菌Y5的混菌實驗組所制備的紅曲米樣品的菌落總數也沒有出現超標的問題，因此將貝萊斯芽孢桿作為輔助菌株以提高紅曲米大規模發酵生產過程的魯棒性是基本可行的。雖然貝萊斯芽孢桿菌作為拮抗益生菌具有巨大的應用潛力，但是其生物安全評價相關的研究報道并不多[14]，因此未來如果要將該菌應用于紅曲米的商業化生產，還應對其生物安全性進行評估。