基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實驗驗證探究骨碎補防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機制

王 杰，鄒德寶，李 琰，王志洲，金 鑫，候 燕，王金鳳，石 威，姜紅江,*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230000；2.山東省文登整骨醫(yī)院，山東 威海 264400）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis, OP）作為一種代謝性骨病，具有全身發(fā)病、骨量減少和骨小梁微結(jié)構(gòu)破壞等表現(xiàn)，以骨皮質(zhì)變薄、骨小梁之間失去連接為典型病理特征[1]，從而增加骨的脆性，使骨折發(fā)生率大幅提升。 OP 可分為Ⅰ型（原發(fā)性）和Ⅱ型（繼發(fā)性）2種。 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis,PMOP）是Ⅰ型骨質(zhì)疏松癥中最高發(fā)的類型[2]。 有研究發(fā)現(xiàn)，全球范圍內(nèi)PMOP 已成為絕經(jīng)后婦女的多發(fā)病[3-4]，這一現(xiàn)象主要歸因于絕經(jīng)后女性雌激素含量大幅減少。 雌激素對保持骨內(nèi)成骨和破骨功能平衡發(fā)揮主要調(diào)控作用，所以絕經(jīng)后婦女出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的主要原因之一就是體內(nèi)雌激素減少[5]。

目前，治療PMOP 的方法主要是通過藥物升高雌激素水平、補充鈣劑、促進鈣吸收、刺激成骨和抑制破骨等，但治療效果均不太理想。 近年來，中醫(yī)藥防治PMOP 逐漸受到越來越多的關(guān)注。

PMOP 是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病名，中醫(yī)古籍中并無相關(guān)描述。 根據(jù)其癥狀可歸為“骨痿”。 中醫(yī)理論分析“骨痿”發(fā)病多因腎精虧虛，進而生髓乏源，導(dǎo)致骨骼失養(yǎng)。 根據(jù)“腎藏精，主骨生髓”的理論，中醫(yī)以骨碎補、淫羊藿、杜仲等補腎中藥為主對骨痿進行防治。骨碎補屬于水龍骨科植物槲蕨的根莖，具有補腎壯骨、活血療傷的功效[6]。現(xiàn)代藥理研究證實，骨碎補有效成分主要為黃酮類、三萜類及木脂素等[7]。 既往藥理及臨床研究已證實，骨碎補具備優(yōu)良的抗骨質(zhì)疏松和促進骨折愈合的功效[8-10]，但其治療PMOP 的具體作用機制尚不明確。 因此，有必要基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動物實驗驗證的方法進一步展開研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種多學(xué)科融合而形成的新學(xué)科，能夠較為全面地反應(yīng)在分子水平上藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的作用機制[11]。 此次研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的手段，從骨碎補的化學(xué)成分基礎(chǔ)出發(fā)，更加系統(tǒng)地深入探究骨碎補治療PMOP 的主要靶點和潛在的分子作用機制，并通過雌性大鼠去勢構(gòu)建PMOP 模型，觀察不同組別大鼠血清E2水平、骨代謝指標及骨密度的變化，來探究骨碎補防治PMOP 的機制。 以期為PMOP 的防治提供理論依據(jù)，同時給新藥開發(fā)提供新思路。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1 骨碎補相關(guān)靶點篩選

通過TCMSP[12]平臺檢索骨碎補的化學(xué)成分并按口服藥物生物利用度≥30%、類藥效性≥0.18[13]兩個ADME 屬性值對活性成分進行篩選， 結(jié)合Swis sTargetPrediction 平臺，勾選“Homo sapiens”選項查找藥物作用的有效蛋白質(zhì)靶點。

1.2 骨碎補活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

蛋白質(zhì)靶點篩選完成后借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫將與化合物相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)靶點進行標準化，使用Cytoscape 3.8.0[14]構(gòu)建骨碎補活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3 PMOP 相關(guān)靶點篩選

通過檢索OMIM 數(shù)據(jù)庫[15]、GeneCards 數(shù)據(jù)庫[16]、TTD 數(shù)據(jù)庫[17]中PMOP 的潛在靶點，設(shè)置“postmenopausal osteoporosis”為關(guān)鍵詞，結(jié)合DrugBank數(shù)據(jù)庫挖掘防治PMOP 的臨床藥物作用靶點[18]。 將上述4 個數(shù)據(jù)庫靶點聯(lián)合并去重，獲取PMOP 的靶點。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為確定骨碎補相關(guān)靶點與PMOP 潛在靶點之間的關(guān)系，運用Venny 2.1.0 平臺將骨碎補相關(guān)成分靶點與PMOP 潛在靶點取交集并制作韋恩圖。 運用STRING 平臺[19]制作PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 骨碎補成分-PMOP 靶點功能與通路的富集分析

將骨碎補防治PMOP 的靶點錄入DAVID 平臺，獲取疾病生物學(xué)過程及其信號通路并加以富集分析，將獲得的4 個數(shù)據(jù)庫資料設(shè)置Count 值為2、P＜0.05；根據(jù)Count 值選用TOP10、TOP20 數(shù)據(jù)，采用微生信平臺制作GO 富集分析條形圖、KEGG 通路富集分析氣泡圖。 為更加直觀地顯示骨碎補治療PMOP所涉及KEGG 通路的相關(guān)靶點，借助Cytoscape 3.8.0構(gòu)建“靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 實驗驗證

2.1 動物與材料

40 只8 周齡SPF 級雌性SD 大鼠，體質(zhì)量220～250 g[許可證號SCXK（魯）20190003，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司]，玉米芯墊料、SPF 級大小鼠繁殖飼料（廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心）。實驗通過山東省文登整骨醫(yī)院倫理委員會批準，批準號：LL2021052701。動物飼養(yǎng)于山東省文登整骨醫(yī)院動物實驗室大鼠IVC 獨立送風隔離籠具內(nèi)，籠內(nèi)溫度22～26 ℃，相對濕度設(shè)定40%～70%，晝夜節(jié)律12 h 間隔照明。

2.2 試劑與儀器

骨碎補中藥飲片來自山東省文登整骨醫(yī)院；E2檢測試劑盒（批號：PE223）、BALP 檢測試劑盒（批號：P0321S）、TRAP 檢測試劑盒（批號：P0332）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；苯巴比妥鈉注射液（批號：2103071，天津金耀藥業(yè)有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（批號：2101010523，辰欣藥業(yè)股份有限公司）；75%乙醇（批號：210107，山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司）；Micro CT（型號：NMC-100，平生醫(yī)療科技有限公司）；離心機（型號：Sorvall ST 16R，賽默飛世爾科技公司）。

2.3 方法

2.3.1 分組與造模 40 只雌鼠經(jīng)7 d 適應(yīng)性喂養(yǎng)后，按隨機數(shù)字表法分成空白組、假手術(shù)組、模型組、骨碎補組，每組10 只。空白組無手術(shù)干預(yù)，其余各組大鼠分別用苯巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，麻醉完成后行術(shù)區(qū)備皮，75%乙醇消毒，經(jīng)背側(cè)腰椎旁入路各做一縱切口，長約1.5 cm，逐層切開各層組織直至腹腔，模型組和骨碎補組大鼠摘除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組摘除卵巢周圍等量脂肪，術(shù)區(qū)止血，縫合切口。 術(shù)后各組大鼠切口按時消毒，定期更換墊料，預(yù)防感染。

2.3.2 骨碎補煎液制備 骨碎補飲片100 g 置于鍋中，加三蒸水浸泡60 min，調(diào)整液面，大火煮沸，繼續(xù)用小火煮30 min，濾出煎液，鍋中再次加入水，二煎，火候控制同前，時長20 min，同前濾出煎液，與頭煎湯液混合，繼續(xù)文火蒸餾至100 mL，得到骨碎補煎液（1 g/mL），4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 給藥 繼續(xù)飼養(yǎng)2 周后給藥，灌胃劑量根據(jù)動物與人體間的等效劑量換算方法，成人記為a，大鼠記為b。D、R、S 分別代表劑量、換算系數(shù)和校正系數(shù)，公式如下：Db=Da×Rab×Sb[20]。成人取標準體質(zhì)量60 kg，給藥前大鼠平均體質(zhì)量約300 g。 得到骨碎補煎液灌胃劑量(6.1 g/kg)，其余各組每天灌胃相應(yīng)體積生理鹽水。每14 天再次稱重調(diào)整灌胃劑量。 每天灌胃1 次，持續(xù)12 周。 灌胃結(jié)束后全部大鼠依次麻醉，行腹主動脈取血，離心后留取血清并分離雙側(cè)股骨。

2.3.4 檢測指標及方法采集不同組別大鼠血清，依照各檢測指標檢測試劑盒使用說明進行雌二醇（estradiol, E2）、骨源性堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase, BALP)及抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase, TRAP）檢測，運用Micro CT 行大鼠股骨BDM 檢測，并通過自帶軟件對股骨近端和遠端進行骨密度（bome mineral density, BDM）分析。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果

3.1.1 骨碎補活性成分與靶點的獲取 初步提取骨碎補的化學(xué)成分71 種，有效成分作用靶點587 個。經(jīng)ADME 篩選和SwissTargetPrediction 平臺補充后，刪去不能獲取信息的成分，共獲得骨碎補16 種有效活性成分，有效成分對應(yīng)的靶點171 個。 包括柚皮苷、山柰酚和木犀草素等。利用Cytoscape 3.8.0 對骨碎補成分連同作用靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進行繪制。 詳見圖1。

3.1.2 PMOP 相關(guān)靶點的獲取 從GeneCards 數(shù)據(jù)庫中獲得PMOP 潛在靶點，然后結(jié)合OMIM、Drug-Bank、TTD 數(shù)據(jù)庫對相關(guān)靶點進行補充，合并上述數(shù)據(jù)庫有關(guān)靶點后除去重復(fù)值，最終獲取611 個PMOP有關(guān)靶點。

3.1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選出來的藥物有效活性成分靶點與PMOP 靶點取交集，并借助Venny 平臺制作韋恩圖，得到骨碎補藥物成分-PMOP 共同靶點74 個，見圖2。 運用STRING 平臺構(gòu)建骨碎補和PMOP 共同靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)。 詳見圖3。

3.1.4 靶點功能與通路的富集分析 應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)平臺對獲取的74 個潛在靶點進行信號通路GO 富集分析，分別選取Top10 運用微生信平臺對結(jié)果進行可視化，見圖4。 由結(jié)果可見多個靶點的功能與PMOP 的發(fā)病緊密聯(lián)系。 骨碎補參與的重要生物過程包含RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)、氧化還原過程、凋亡過程的負調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。在細胞組分中，主要作用于細胞核、細胞質(zhì)和質(zhì)膜等。 相關(guān)靶點調(diào)節(jié)PMOP 的分子功能主要富集于蛋白結(jié)合、酶結(jié)合和蛋白質(zhì)同源二聚化活性等。 將KEGG通路Top 20 結(jié)果繪制成氣泡圖，見圖5。KEGG 富集通路提示骨碎補可能通過Pathways in cancer、PI3KAkt、TNF、HIF-1 等信號通路和MAPK1、MAPK3、TNF、TGF-β1 等主要靶點參與調(diào)控PMOP。 通過Cytoscape 3.8.0 對骨碎補治療PMOP 所涉及KEGG 通路的相關(guān)靶點進行可視化，見圖6。

3.2 骨碎補對模型大鼠的作用

3.2.1 各組大鼠E2、BALP、TRAP 水平比較 與空白組相比，假手術(shù)組大鼠血清E2、BALP、TRAP 含量均無統(tǒng)學(xué)差異(P＞0.05)。 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清E2、BALP 含量下降(P＜0.01)，TRAP 含量增高(P＜0.01)。 與模型組相比，骨碎補組大鼠血清E2、BALP 升高(P＜0.05、P＜0.01)，TRAP 降低(P＜0.05)。 詳見表1。

3.2.2 各組大鼠股骨BDM 比較 與空白組相比，假手術(shù)組大鼠股骨近端和遠端BDM 水平均無統(tǒng)學(xué)差異(P＞0.05)。 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠股骨近端和遠端BDM 水平顯著降低(P＜0.01)。 與模型組相比，骨碎補組大鼠股骨近端和遠端BDM 水平升高(P＜0.05)，見表2。 空白組和假手術(shù)組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠骨小梁稀疏、斷裂，骨碎補組大鼠骨小梁稀疏、斷裂程度較模型組輕，但仍有破壞。詳見圖7。

圖1 骨碎補活性成分-靶點圖

圖2 骨碎補藥物成分-PMOP 靶點韋恩圖

4 討論

圖3 骨碎補-PMOP 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 靶點GO 富集分析條形圖

圖5 靶點KEGG 通路富集分析氣泡圖

圖6 骨碎補防治PMOP“靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖

表1 各組大鼠血清BALP、E2、TRAP 含量（±s，n=10）

表1 各組大鼠血清BALP、E2、TRAP 含量（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組相比，△P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.01，**P＜0.05。

組別空白組假手術(shù)組模型組骨碎補組BALP/(μg/L)217.72±20.53 218.30±17.23#135.00±10.24△176.39±12.79*E2/(ng/L)8.09±1.38 8.15±1.46#5.31±0.72△6.30±0.91**TRAP(ng/L)2.24±0.13 2.25±0.10#2.86±0.17△2.51±0.17**

表2 各組大鼠股骨近端、遠端BDM 水平（±s，n=10，g/cm2）

表2 各組大鼠股骨近端、遠端BDM 水平（±s，n=10，g/cm2）

注：與假手術(shù)組相比，△P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05。

股骨近端BDM 0.212 39±0.012 62 0.215 63±0.013 29#0.179 79±0.016 54△0.206 31±0.007 90*股骨遠端BDM 0.262 20±0.013 08 0.262 61±0.013 49#0.216 13±0.014 72△0.258 52±0.016 61*組別空白組假手術(shù)組模型組骨碎補組

圖7 各組大鼠股骨近端、遠端CT 斷層掃描

隨著人口老齡化的加劇，我國老年人比例不斷上升，因骨質(zhì)疏松所造成的病理性骨折的發(fā)生率逐年增加，尤其是絕經(jīng)后女性更為嚴重，使家庭和社會承受了極大的經(jīng)濟壓力，已經(jīng)成為社會面臨的嚴重挑戰(zhàn)[21]。 根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會2018 年調(diào)查結(jié)果表明，我國超過50 歲居民發(fā)病率為19.2%，超過65 歲居民發(fā)病率達到32.0%，且女性患病率較男性顯著提高[22]。 研究證實，在絕經(jīng)后女性中，雌激素分泌減少能夠刺激破骨細胞分化，增加骨細胞凋亡，并抑制成骨細胞分化功能[23-24]。 BALP 和TRAP 作為反映骨形成和骨吸收的敏感指標，常用于監(jiān)測機體骨代謝情況[25]。骨密度是診斷OP 的重要指標，具有較廣泛的臨床應(yīng)用。 PMOP 發(fā)病往往伴隨著BALP 和TRAP 水平變化和骨密度下降。

根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，PMOP 可歸為“骨痿” 范疇。中醫(yī)古籍關(guān)于“骨痿”的描述最早見于《素問·痿論篇》：“腎主身之骨髓……骨枯而髓減，發(fā)為骨痿。”骨碎補作為傳統(tǒng)中藥材，具有悠久的藥用歷史[26]。《開寶本草》曰：“骨碎補主破血，止血，補傷折。 ”其補腎益精、續(xù)筋接骨的功效被歷代醫(yī)家廣泛地用于治療各種骨傷科疾病。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白組與假手術(shù)組大鼠各項指標均無統(tǒng)計學(xué)差異。 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清E2、BALP 和BMD 顯著下降(P＜0.01)，TRAP明顯升高(P＜0.01)，提示造模成功。 骨碎補組大鼠血清E2、BALP 和BDM 均高于模型組(P＜0.01)，TRAP水平較模型組降低(P＜0.01)，說明骨碎補能夠改善PMOP 大鼠E2水平，促進成骨細胞功能，抑制破骨細胞活性，同時能夠提高骨密度，從而對PMOP 發(fā)揮治療作用。

由于骨碎補的化學(xué)組成成分復(fù)雜，決定了其發(fā)揮藥理作用可能是通過多個治療疾病的信號通路、蛋白靶點進行調(diào)節(jié)，以發(fā)揮相應(yīng)的作用。 本研究共篩選出骨碎補可能的活性成分16 個， 其中柚皮苷、木犀草素和山奈酚等成分擁有較多的預(yù)測靶點，說明這些化合物可能是骨碎補治療PMOP 的重要活性成分。 柚皮苷作為一種天然黃酮類物質(zhì)，已有研究證實其能促進微循環(huán)，改善成骨細胞增殖和分化[27]。柚皮苷能提高BMP-2 等成骨細胞標志蛋白的表達水平，同時還能減少NF-κB 和ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和破骨細胞基因的蛋白表達水平，進而影響破骨細胞形成，起到緩解骨質(zhì)疏松的作用[28-29]。 骨碎補中另一種主要化合物木犀草素也屬于黃酮類，有研究證實，木犀草素能緩解甲基乙醛對成骨細胞MC3T3-E1 的損傷，可能對糖尿病骨病的預(yù)防起作用[30]。其他體內(nèi)外實驗[31]指出木犀草素可能通過降低破骨細胞分化能力和功能來減少PMOP 的骨流失。 山柰酚作為骨碎補的重要有效成分，對防治OP 有一定效果，能夠緩解因雌激素減少所導(dǎo)致的大鼠骨微結(jié)構(gòu)紊亂[32]。WONG 等[33]提出山柰酚是通過調(diào)控雌激素受體、BMP-2、MAPK 等信號通路來實現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松的作用。 另有研究證實山柰酚可以參與雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活Wnt 信號通路，從而起到骨保護的功效[34]。

根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，得到骨碎補防治PMOP 的靶點包括MAPK1、MAPK3、TNF、TGF-β1 等，表明骨碎補防治PMOP 具有多成分、多靶點的特點。 作為MAPK 家族的主要成員，MAPK1、MAPK3 基因通過編碼相關(guān)蛋白介入細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等。研究證實，來源于大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體，可通過MAPK 途徑產(chǎn)生促進成骨細胞增殖作用，進而延緩OP 的進程[35]。TNF-α 作為TNF 的一種類型，通過炎癥反應(yīng)參與骨重塑，具有刺激OC形成和調(diào)控成骨細胞作用，在維持骨穩(wěn)態(tài)中有重要功能[36]。 研究證實，TNF-α 通過提升巨噬細胞及干細胞中NF-κB 受體激活因子水平，并促進RANKL與其受體RANK 結(jié)合進而刺激OC 的增殖和分化[37]。TGF-β1 是TGF-β 的亞型，在骨組織中含量豐富，在骨發(fā)育及重建過程中具有重要調(diào)節(jié)作用[38]。 劉元等[39]借助動物實驗證實蛇床子素能夠降低去卵巢大鼠血清BGP 含量，升高TGF-β1 水平，表明蛇床子素能夠調(diào)節(jié)大鼠激素水平，明顯改善去勢雌鼠的骨代謝異常，增加骨密度，進而防治骨質(zhì)疏松。

KEGG 通路富集分析顯示，骨碎補對PMOP 的防治作用主要通過Pathways in cancer、PI3K-Akt、TNF、HIF-1 等信號通路。Pathways in cancer 較為復(fù)雜，包括Wnt 信號通路、Hedgehog 信號通路、Notch信號通路等多個下游通路[40]。其中，Wnt 蛋白是一組分泌的糖蛋白，是促進成骨細胞分化和活性的重要調(diào)節(jié)因子[41]。ZHU 等[42]證實，PI3K/Akt 信號通路具有促進成骨細胞增殖、分化和成骨作用而緩解骨質(zhì)疏松。 TNF 主要介導(dǎo)細胞凋亡及炎癥和機體免疫，參與調(diào)節(jié)包括糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、多發(fā)性硬化癥和類風濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病的發(fā)病機制[43]。 陳鵬等[44]發(fā)現(xiàn)TNF-α 通過介導(dǎo)NF-κB 來增加RANKL 誘導(dǎo)的破骨細胞形成以防治PMOP。已有研究證實，HIF-1具有促進破骨細胞形成、增強破骨細胞活性的作用[45-46]。該通路在組織缺氧時緊密參與了血管形成、骨吸收和骨生成的修復(fù)過程[47]。 由此預(yù)測，骨碎補可通過Pathways in cancer、PI3K-Akt、TNF、HIF-1 等 信 號通路和MAPK1、MAPK3、TNF、TGF-β1 等靶點達到改善骨量的目的，對PMOP 有治療效果。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合動物實驗驗證的方法探討了骨碎補治療PMOP 的潛在作用機制，證實了骨碎補治療PMOP 具有多成分、多靶點、多途徑的作用機制特征。 課題組擬在后續(xù)研究中基于不同骨碎補藥物濃度進一步探討骨碎補治療PMOP 作用機制及作用效果，為現(xiàn)代藥物研發(fā)提供思路。