丹瓜方對肥胖糖尿病大鼠PPARγ、CPT-1表達的影響

何衛(wèi)東，衡先培，楊柳清，翁淑琴，李 亮，王志塔

（福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004）

糖脂代謝紊亂性疾病的基本特征是能量過剩，臨床常見超重或肥胖，常合并系列疾病，包括糖尿病、高脂血癥等，其中肥胖2 型糖尿病最具代表性［1］。肥胖糖尿病患者多屬“痰瘀互結(jié)”，治療上宜活血化瘀、祛痰通絡。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，痰瘀同治法代表方丹瓜方可有效調(diào)節(jié)糖尿病血糖水平及其脂代謝紊亂［2-4］，其具體作用機制尚需要進一步研究揭示。因此，本研究采用丹瓜方對肥胖糖尿病模型大鼠進行干預，觀察其對肥胖糖尿病大鼠肝臟過氧化物酶體增殖物活化受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）和腎周脂肪肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1）含量的影響，進一步闡明丹瓜方干預肥胖2 型糖尿病脂代謝的作用機理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 45 只 SPF 級 7 周齡 SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量（300±15）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（閩）2014-0005。飼養(yǎng)條件：12 h明暗交替，溫度（23±2）℃，濕度50%～70%，良好通風，分開籠位飼養(yǎng)，自由飲水。大鼠飼料分為普通飼料、高脂飼料，高脂飼料購自福貝世享生物醫(yī)藥上海有限公司，配方比例：精煉豬油10.00%，膽固醇2.00%，丙基硫氧嘧啶0.07%，豬膽鹽0.30%，普通飼料87.63%。本動物實驗經(jīng)福建中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會審核通過，審批號：［2017］福中醫(yī)倫理審字第（015）號。

1.2 實驗藥物 丹瓜方液（福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院藥劑科配制，批號：120928，原生藥1 g/mL藥液），由丹參、瓜蔞、赤芍、川芎、法半夏、薤白等組成。

1.3 實驗試劑和儀器 鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma 公司，批號：S8050）；二甲雙胍片（上海信誼藥廠有限公司，生產(chǎn)批號：161026B）；PPARγ、CPT-1 ELISA 試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，批號：F16566、F15244）；ELX800 全自動酶標儀（美國BioTek 公司）。

2 實驗方法

2.1 造模方法 參照文獻［5］建立糖尿病模型，高脂飲食飼養(yǎng)4 周，測量空腹體質(zhì)量，在大鼠空腹狀態(tài)下于每日早晨8：00 以25 mg/（kg·d）劑量腹腔注射STZ，連續(xù)注射2 d。末次注射 STZ 后48、72 h分別測量空腹血糖（FBG）；選取 2 次 FBG 均≥11.1 mmol/L 或非同日2 次隨機血糖≥16.7 mmol/L者視為造模成功。

2.2 分組與干預 將45 只SD 大鼠隨機分為對照組9 只、造模組36 只，對照組飼以普通飼料，造模組按“2.1”項下的造模方法進行造模。采用隨機數(shù)字表法將36 只造模成功的大鼠分為模型組、二甲雙胍組、常規(guī)劑量丹瓜方組（簡稱常規(guī)劑量組）、高劑量丹瓜方組（簡稱高劑量組），每組9 只。二甲雙胍組按0.11 g/（kg·d）予二甲雙胍藥液灌胃，常規(guī)劑量組、高劑量組分別按13.3、20 g/（kg·d）予丹瓜方藥液灌胃，對照組和模型組以等量無菌水灌胃，每日灌胃1次，共連續(xù)灌胃16 周。

2.3 標本采集 使用10%水合氯醛對實驗大鼠進行腹腔麻醉（0.3 mL/100 g），分離出肝臟并在預冷的PBS 中清洗2 遍，用濾紙吸去多余水分，切取肝右葉外1/3～外2/3 放進EP 管檢測備用。取左腎周脂肪，在預冷的PBS 中清洗2 遍，在濾紙上吸去多余水分，取材后將組織迅速裝入EP 管中，保存于-80 ℃冰箱備測。

2.4 指標檢測 ELISA 法檢測5 組大鼠肝組織PPARγ、腎周脂肪組織CPT-1 含量，按照試劑盒說明書進行檢測。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計學處理。計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LCD-t檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

與對照組比較，模型組大鼠肝臟組織PPARγ和腎周脂肪CPT-1 含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量組大鼠肝臟PPARγ 含量明顯升高（P＜0.05），二甲雙胍組、常規(guī)劑量組和高劑量組大鼠腎周脂肪CPT-1含量均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 5 組大鼠肝組織PPARγ 和腎周脂肪CPT-1 含量比較（） pg/mL

表1 5 組大鼠肝組織PPARγ 和腎周脂肪CPT-1 含量比較（） pg/mL

注：與對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01，3）P＜0.05。

組別對 照 組模 型 組二甲雙胍組常規(guī)劑量組高劑量組CPT-1 597.37±48.61 336.79±30.131）398.35±54.962）430.56±50.252）392.15±23.683）n9 9 9 9 9 PPARγ 9 743.96±715.05 8 474.23±753.591）8 895.41±980.18 9 031.71±585.52 9 426.41±1299.123）

4 討 論

PPARγ、CPT-1 在糖尿病及脂代謝病變過程中發(fā)揮重要的作用。PPARγ 是核激素受體超家族中的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，其主要與脂肪細胞的生成密切相關(guān)，可調(diào)節(jié)血脂、改善胰島素抵抗，進而起到降血糖作用［6］。有證據(jù)顯示 PPARγ 與糖脂代謝密切相關(guān)，因此體內(nèi)PPARγ 水平可反應糖尿病脂代謝程度［7］。激活的PPARγ 能夠增加白色脂肪組織中總膽固醇含量，使肝臟及肌肉中總膽固醇含量降低，以實現(xiàn)降低胰島素抵抗的目的；活化的PPARγ 可通過激活脂肪分泌細胞來減少TNF-α 的分泌，提高胰島素的敏感性，降低血脂，進而影響糖尿病脂代謝的發(fā)展［8］。也有臨床研究表明，2 型糖尿病患者血清PPARγ 水平降低，病情好轉(zhuǎn)后PPARγ 水平回升［9］。CPT-1 是脂肪酸氧化過程中的一種限速酶，催化脂肪酸轉(zhuǎn)運至線粒體基質(zhì)進行β 氧化。在糖尿病脂代謝方面，乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）和羥甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMGR）是AMP 依賴的蛋白激酶（AMPK）的靶蛋白，AMPK 活化可以促使HMGR 和ACC 被磷酸化而失去活性，后兩者分別是膽固醇和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，由此AMPK活化可以抑制膽固醇和脂肪酸合成［10-12］。丙二酰輔酶 A 是 CPT-1 的抑制物［13］。AMPK 活化則導致丙二酰輔酶A 合成減少，解除了對CPT-1 的抑制，增強了脂肪酸氧化，可減輕脂肪變性并降低脂質(zhì)在外周組織的沉積，進而改善脂代謝［14］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠肝臟PPARγ 含量及腎周脂肪CPT-1 含量均顯著降低，提示機體在糖尿病狀態(tài)下容易發(fā)生糖脂代謝障礙，從而對機體造成不利影響。

糖尿病屬于中醫(yī)學“消渴”范疇，在我國古代常與“脾癉”“消癉”“消證”“消病”等混稱，與津液代謝密切相關(guān)。中醫(yī)學對消渴的病因病機有詳細的論述，如《素問·痹論》提出“飲食自倍，腸胃乃傷”，實則是攝入熱量過多損傷脾胃。痰濁、血瘀是糖尿病的重要病理因素，痰瘀互結(jié)是糖尿病的重要病機。消渴患者脾胃損傷后，胃不能正常腐熟水谷而排入腸道，小腸也不能有效地分清泌濁，導致機體吸收營養(yǎng)物質(zhì)清濁混雜，水谷不能正常傳化而變生為痰濁。痰濁一旦產(chǎn)生，即可帶來2 個惡性循環(huán)：一是因脾屬中土，易被痰濕所困，脾又為生痰之源。今因過食致腸胃受傷而生痰濁，痰濁之邪壅遏脾土，損傷脾運，導致運化無力，再生痰濕濁之邪，形成第1 個惡性循環(huán)。二是因痰瘀互生，痰濁已成，妨礙氣血津液運行，產(chǎn)生瘀血，因痰而生瘀。瘀血既成，又可阻礙津液的敷布，反過來也促進痰邪的形成和加重，形成痰濁與瘀血互為因果、相互促進的第2 個惡性循環(huán)。2 個惡性循環(huán)互相促進，終致痰瘀互結(jié)、積病難消。針對糖尿病痰瘀互結(jié)這一重要病機，課題組精心研制了體現(xiàn)“痰瘀同治”法的中藥復方丹瓜方來治療糖尿病。丹瓜方主要由丹參、瓜蔞、赤芍、川芎、法半夏、薤白等組成，具有祛痰化瘀的功效，臨床中治療痰瘀互結(jié)證糖尿病療效顯著，現(xiàn)已成為我院院內(nèi)制劑。

前期實驗研究表明，丹瓜方能顯著降低肥胖糖尿病鼠血糖、甘油三酯及膽固醇水平，改善肝功能［5，15］。本課題進一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，經(jīng)丹瓜方藥物干預后大鼠肝臟組織PPARγ 和腎周脂肪CPT-1 含量明顯升高，提示丹瓜方可減少糖尿病大鼠膽固醇和脂肪酸合成并降低脂質(zhì)在外周組織的沉積，從而改善糖尿病脂代謝。西醫(yī)治療2 型糖尿病的一線用藥二甲雙胍對糖脂代謝有較好的調(diào)節(jié)作用，丹瓜方和二甲雙胍具有部分類似的作用。