數字全息波前聚焦算法在生物成像中應用

匡青云，趙志雄，楊 鴻

（1.重慶城市職業管理學院，重慶 400054；2.重慶機電職業技術大學，重慶 400054；3.重慶電子工程職業學院，重慶 400054）

引言

隨著生物醫學和生命科學的快速發展，定性、平面和非實時觀測培養液中的生物細胞已經不能滿足現代化研究需求。為了觀察細胞的結構形態、生理參數、藥物對細胞的作用機理及細胞間相互作用等動態特性，對觀測提出了定量、三維和實時響應的要求。數字全息術是把全息圖記錄下來后儲存于電腦中，利用光電子元件CCD(或CMOS)作為介質，利用衍射傳播理論對目標的光波復原及傳輸進行仿真。物光波傳輸經過不同折射率或厚度不同的目標物體或目標物體受到溫度變化等環境影響發生熱物理性質改變時，它的實際距離是難以精確測量的。在數字全息重現過程中，重現距離直接受到真實記錄距離的影響，當重現距離與真實記錄距離出現較大偏差時，物體的重現就像是模糊不清，信噪比降低，觀測精度下降。數字全息運用菲涅爾- 基爾霍夫衍射理論數字重建物體波前[1]，該數值化過程可采用聚焦函數和聚焦算法來確定最佳再現距離，使最佳聚焦位置處的再現像清晰，信噪比提升，有利于高精度測量。

目前，聚焦算法中廣泛運用物體波前的振幅信息[2-3]。沿光軸重建出的一系列再現像，聚焦函數在最大或最小值等函數特征點時再現像銳利度最高，最清晰。常用熵[4]，方差[5]，頻譜[3]以及使用相關系數法作為聚焦函數的評價參數來確定重建像的最佳聚焦位置。

在介紹全息理論基礎之上，作為聚焦算法獲得最佳聚焦位置的基本原理，分析利用物體振幅信息的相關系數法。介紹物體相位信息的相關系數法，在對纏繞相位信息進行解包處理后，作為判別焦平面過程的聚焦算法。將含有尺寸大小不同的圓形顆粒標準靶面作為目標物體分析從物體振幅和相位信息聚焦算法中所得最佳聚焦距離的加權結果對比結果。將洋蔥表皮生物細胞標本為目標觀測物體，分析不同聚焦算法即振幅信息的聚焦算法，相位信息的聚焦算法，波前信息的聚焦算法所得重建像銳利度，觀測生物細胞標本的三維形貌。

1 基本原理

1.1 相關系數法的基本原理

相關系數法（CC）計算以該平面為中心光軸左右對稱兩側重建像的相似程度作為評價參量，相關系數法（CC）計算以該平面為中心光軸左右對稱兩側重建像的相似程度作為評價參量，在CC 值為1，代表兩個平面形象完全相似，該目標的中心面為最優的重構造。在0 時，通過對某一步驟的步長分析，進一步計算出目標平面，而目標平面左右對稱平面沒有相似性，無法確定最優聚焦位置。將光軸切片地重建物體的強度重構象沿著?z 固定步長，?CZ/2 為左右對稱平面與中心平面之間的距離，并利用該相關因子的峰值來判定焦平面的位置在光軸上的重構象對稱的兩面圖像之間的關聯性。

在CC 值為1，代表兩個平面形象完全相似，該目標的中心面為最優的重構造。在0 時，通過對某一步驟的步長分析，進一步計算出目標平面，而目標平面左右對稱平面沒有相似性，無法確定最優聚焦位置。將光軸切片地重建物體的強度重構象沿著?z 固定步長，?CZ/2 為左右對稱平面與中心平面之間的距離，并利用該相關因子的峰值來判定焦平面的位置在光軸上的重構象對稱的兩面圖像之間的關聯性。

1.2 振幅和相位的焦平面方法

利用測量方法可以大致測量出目標的記錄距離，但是由于光相干成像技術的傳輸特性和目標對象的動力學特性，導致了目標的熱物理性質會引起目標的表面變形或位移，當外部因素的影響時，目標的熱物理性質就無法精確地測量出實時光學系統中目標的記錄距離。復建離焦圖像模糊物體信息不失去，復建圖像清晰物體焦平面在理想狀態下不失去。合理的自動聚焦算法在數字全息的數字化重建過程中通過聚焦函數準確判斷最佳焦平面位置，在高精度測定中，例如MEMS 故障檢測等具有重要意義。物體波前表示為E（x，y）=a（x，y）exp[iφ（x，y）]，a（x，y）為物體振幅信息，φ（x，y）為物體相位信息，a（x，y）或φ（x，y）只是物體波前信息中的某部分信息，將a（x，y）和φ（x，y）同時運用于聚焦算法中，準確確定再現距離，提高焦平面定位精度。

物體波前的相位信息被包裹在2π 中，當物體的相位信息大于一個波長時。通過對解包裹后的相位信息進行計算，可以得到目標的相位信息，這是由于相位解包裹方法的發展而產生的。采用相關系數方法，采用解包后的相位信息作為評估參數，能夠準確地判定目標的焦平面最優的位置。通過理論和試驗，證明了該聚焦算法在焦平面上的最大聚焦函數曲線中，得到的曲線呈現出對稱的分布，兩側對稱圖像的相似性較高或一致。沿著光軸分析目標物體重建像，得到用相位信息作為參量的相關系數法聚焦函數曲線，最高峰值處為最佳聚焦位置。

利用波長632.8 nm 激光，CCD 分辨率2 048×2 048，7.4 um×7.4 um，以不同尺寸各顆粒徑標準靶面上為觀察對象來驗證相位信息運用于聚焦算法的可行性，并對比分析振幅聚焦函數，相位聚焦函數，波前信息聚焦函數。靶面圖像及相應的全息圖見圖1。將振幅信息和相位信息運用于相關系數法聚焦函數，函數曲線及對應峰值重建像見圖2。振幅信息和相位信息的聚焦函數峰值確定的最佳聚焦位置為181.47 mm和181.20 mm。運用線性加權原理，將振幅信息和相位信息加權作為定焦算子，最終得到的最佳重建位置為181.335 mm。加權后的最佳聚焦位置同時將物體振幅和位相作為聚焦參量，完成物體波前信息作為參量的聚焦。

圖1

圖2

2 實驗過程

通過波長632.8 nm 激光，CCD 分辨率36642748，像元大小1.67 um×1.67 um 為實驗儀器，洋蔥表皮細胞制成的生物標本為觀測對象，建立了數字化全息成像體系，并對其進行了試驗和分析。洋蔥表皮細胞因生長周期不同而不同，且受到外界環境影響，一般為微米量級。在洋蔥表皮細胞成像后，利用有關系數聚焦曲線和重建強度，對其幅度和解包裹相位進行了分析。振幅和相位曲線峰值確定的最佳重建位置為151.25 mm 和152.95 mm，物體波前信息判定的最佳重建位置為152.1 mm。位相分布圖及位相局部分布放大圖分別見圖3 和圖4。

圖3 不同重建方法位相分布結果

圖4 放大圖

3 結論

振幅，相位和波前聚焦算法的洋蔥表皮細胞強度重建像中，相位聚焦確定的最佳聚焦位置邊緣處對比清晰，振幅確定的焦平面邊緣較相位模糊，但表皮細胞的重建像相對清晰。波前信息重建結果較好，對比度高。洋蔥表皮細胞相位重建結果進行分布，將相位信息作為聚焦算法參量的分布，邊緣銳化明顯，明顯區別于載玻片，但是在表皮邊緣內部的細胞則銳利度不高與背景的區分不明顯。觀察振幅信息作為聚焦算法參量的位相分布，表皮區域內細胞清晰度高形態可見，但是表皮周邊細胞模糊，形態不明顯。同時物體振幅和相位即目標物體整體波前信息作為聚焦算法參量的位相分布放大圖，表皮邊緣細胞清晰度高于運用振幅信息作參量進行聚焦重建像，且表皮內部的細胞形貌清晰可見，優于將相位信息作為參量的聚焦重建像。從目標觀測物體的強度和位相分布中的對比分析，將物體振幅和相位作為相關系數法聚焦參量的聚焦算法具有優越性，能提高單一聚焦參量的聚焦算法最佳重建像的質量。