尿外泌體中致纖維化基因表達在早期糖尿病腎病診斷中的作用研究

宋瀾瀾，賴麗莎，方秀珠，謝嶺平，揭育幫，鄧仁堂，陳載鑫，付文金

1.廣東醫科大學檢驗醫學研究所，廣東東莞 523808；2.廣東醫科大學附屬厚街人民醫院檢驗科，廣東東莞 523945

隨著生活水平的提高，逐年遞增的早期糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）發病率已成為全球重要公共衛生問題。尿病腎病是糖尿病常見的微血管并發癥，是導致糖尿病患者終末期腎衰竭的主要原因，也是糖尿病主要死因之一[1]。其發病機制復雜，病理改變多樣，目前臨床尚無有效手段能阻止DN的發生發展，DN的防治也未獲得令人滿意的效果[2]。早期預測和診斷是有效改善糖尿病患者的療效和預后的關鍵。研究表明，腎小管損傷導致氧化應激、缺氧、慢性炎癥及纖維化等改變，進而影響腎小球濾過功能，二者損傷會相互促進、加重腎臟功能惡化，共同推進DN的發生發展[3]。因此，研究高糖刺激近端腎小管上皮功能改變及其對腎臟損傷的具體機制有重大意義。

本文選取2019年5月—2020年6月于廣東醫科大學附屬厚街人民醫院住院的新診斷早期糖尿病腎病患者16例及2型糖尿病腎病患者16例，探討尿外泌體中致纖維化基因表達在不同嚴重程度下糖尿病腎病以及健康人群中的基因表達情況，并對存在差異表達的miRNA的臨床價值進行探討，確定具有潛在應用價值miRNA，為DN的早期診斷提供新的可靠標志物；同時深入研究腎小管上皮外泌體miRNA表達在DN發病機理中的作用機制，亦為DN的治療提供新靶點，為早期糖尿病腎病患者預防和治療提供科學依據?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于本院住院的新診斷早期糖尿病腎病患者16例及2型糖尿病腎病患者16例，將這32例患者納入研究組，其中16例早期2型糖尿病腎病患者為研究組A組，16例2型糖尿病腎病患者為研究組B組。同時取同期到醫院進行體檢的健康體檢者16名，納入對照組。其中研究組A組中男7例，女9例；平均年齡（58.23±6.52）歲，平均病程（4.67±3.82）年。B組中男8例，女8例；平均年齡（55.67±5.28）歲，平均病程（6.35±3.42）年。對照組中男11例，女5例；平均年齡（54.23±5.59）歲。3組研究對象的年齡、性別、病程、吸煙史、BMI等一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究均取得患者及其家屬的認可，且獲得倫理委員會的批準。研究組中男18例，女15例；平均年齡（58.23±6.52）歲，平均病程（4.67±3.82）年。對照組中男11例，女5例；平均年齡（54.23±5.59）歲，平均病程（1.56±1.21）年。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①符合1999年世界衛生組織糖尿病腎病診斷標準；②糖尿病病程≥3年，未接受過糖尿病腎病藥物治療；③年齡26～75歲、性別不限；④體質指數＞18.5 kg/m2。

排除標準：①1型及其他特殊類型糖尿病患者；②自身免疫性疾病、病毒性肝炎、糖尿病外代謝性疾病和高血壓導致的腎臟疾病，及合并嚴重心肝肺疾病者。

1.3 方法

1.3.1 體外高糖刺激前期研究收集了32多例2型糖尿病患者標本，通過芯片分析技術檢測近十種腎損傷標志物即外泌體miRNA，并發現部分腎小管損傷標志物可先于腎小球出現病理改變，以及血糖、TGF-β1可刺激DN患者尿液Smad1的表達。

1.3.2 血肌酐、尿白蛋白、尿鈉的檢測患者入院第2天空腹（入院當天22:00后禁食水，次日晨起6:00）抽取靜脈血收集臨床數據，生化指標由全自動生化分析儀AU5821或各種免疫法測定。

1.3.3 尿外泌體致纖維化基因表達的檢測 取患者的晨尿400 mL，加入疊氮鈉13.4 mL、20 mLPMSF、400 μL的亮抑蛋白,在低溫短暫保留后，離心和沉淀，再通過Western Blot進行外泌體的鑒定、外泌體總mRNA的提取、轉錄cDNA，再采用實時定量PCR法(RT-qPCR)檢測患者尿外泌體中纖維化基因（TGF-β1和CTGF）的表達，以GAPDH為內參照。引物設計與并合成分別為：TGF-β1引物 上游5-TCCTGGCGATACCTCAGCAA-3，下游5-gtagtgaacccgttgatgtcca-3,擴增產物200 bp；CTGF引物上游5-ggtgtggctttaggagcagt-3，下 游5-tgatggctggagaatgcaca-3,擴增產物247bp；GAPDH引物上游5-atcccatcaccatcttcc-3，下 游5-tgacccttttggctcccc-3，擴 增 產 物160bp。

1.4 觀察指標

觀察兩組患者血肌酐、尿白蛋白、尿鈉等的水平及對比兩組患者尿外泌體中轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)。CTGF的mRNA的表達等相關情況；同時統計兩組患者的一般資料。

1.5 統計方法

采用SPSS 26.0統計學軟件處理數據，計量資料符合正態分布，以(±s)表示，兩獨立樣本采用t檢驗，非正態分布者采用兩獨立樣本的非參數檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者血肌酐、尿白蛋白、尿鈉的水平比較

研究組A組血肌酐、尿白蛋白、尿鈉水平明顯高于對照組；2型糖尿病腎病B組患者的血肌酐、尿白蛋白、尿鈉水平更高于早期糖尿病腎病研究組A組患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組患者血肌酐、尿白蛋白和尿鈉水平對比(±s)

表1 3組患者血肌酐、尿白蛋白和尿鈉水平對比(±s)

組別A組（n=16）B組（n=16）對照組（n=16）F值P值血肌酐（μmol/L）107.5±10.8141.7±31.475.4±6.210.31＜0.05尿白蛋白（mg/L）105.7±9.6141.4±35.968.9±8.69.82＜0.05尿鈉［mmol/（kg·h）］238.9±29.5279.5±42.9110.6±10.721.03＜0.05

2.2 3組 患 者 尿 外 泌 體 中TGF-β1和CTGF的mRNA表達對比

研究組A組和B組患者尿液中的TGF-β1和CTGF的mRNA的表達水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。研究B組患者尿液中的TGF-β1和CTGF的mRNA表達水平明顯高于研究A組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組患者尿外泌體中TGF-β1和CTGF的mRNA表達水平對比(±s)

表2 3組患者尿外泌體中TGF-β1和CTGF的mRNA表達水平對比(±s)

組別A組（n=16）B組（n=16）對照組（n=16）F值P值TGF-β1 2.2±0.84.1±1.21.0±0.23.56＜0.05 CTGF 1.8±1.13.8±1.81.1±0.33.28＜0.05

3 討論

DN是糖尿病常見的微血管并發癥，腎小管及其間質的病變，被認為是影響DN預后的重要因素，嚴重威脅著人類的生命健康，早期診斷是有效改善DN患者預后的關鍵[4]。臨床上認為糖尿病腎病的發生生理機制主要有：腎小球持續性的高壓、蛋白激酶以及醇化反應被激活、過度糖基化[5-6]。同時患者腎臟損害的分子機制較多，過去臨床上判斷糖尿病腎病的指標主要為尿白蛋白、血肌酐等，但是這些指標在敏感性方面存在缺陷。因此，探索更佳有效的早期診斷指標具有重要意義[7]。近年來的研究顯示外泌體miRNA參與多種疾病的發生發展，并成為臨床診斷、預后判斷的重要標志物[8]。然而，DN患者中腎小管間質外泌體分泌及其miRNA是如何改變的，鮮有報道。本文通過對早期糖尿病腎病患者尿液外泌體中纖維化基因TGF-β1和CTGF的mRNA的表達情況進行研究，探索TGF-β1和CTGF的mRNA的表達對于診斷早期糖尿病腎病的意義。

激腎小管上皮細胞（HK-2細胞系），采用芯片技術檢測存在差異表達的外泌體miRNA；然后對DN患者和對照組尿液檢測這些外泌體miRNA，確定其在臨床中的應用價值，為DN的早期診斷提供新的標志物；最后采用生物信息學技術，分析這些差異表達的腎小管外泌體miRNA在DN作用機理，為DN的治療提供新思路[9-10]。外泌體（exosomes）是由不同細胞分泌的直徑30～100 nm脂雙分層的膜性囊泡，包含有來源細胞所特有的蛋白質、微小RNA（miRNA）等生物信息分子，病理與生理狀態下細胞所分泌的外泌體負載的信號分子差別較大，相關分子可作為疾病診斷、干預治療、預后評估的新型標志物[11]。miRNA是一類具有生物活性的非編碼短鏈RNA，廣泛參與個體發育、細胞增殖與凋亡等生命活動。成熟miRNA占外泌體所有RNA的41.7%，作為miRNA的富集體，外泌體是miRNA研究的可靠載體[12]。外泌體miRNA的異常表達參與多種疾病的發生發展，并成為多種疾病臨床診斷及預后判斷的重要標志物，近年來腎小管及其間質的病變在DN中的作用日益受到重視，被認為是影響DN遠期預后的主要因素[13]。

早期糖尿病腎病的發展與細胞外基質過度的沉淀有著密切的聯系，細胞外基質出現過度的沉淀就會導致人體的腎臟細胞受損，進而發展為尿毒癥終末期。TGF-β1和CTGF作為纖維化基因，其基因的激活和表達能夠提示患者腎病的發展情況。TGF-β1基因能夠在細胞增殖、細胞生長、細胞凋亡、細胞分化、免疫反應燈多個途徑下對纖維化進程進行調節。當TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3處于休眠狀態時，會被多種酶激活，再激活TGF-β，進而將Smad2和Smad3進行激活，被激活的Smad2和Smad3會與Smad4發生結合，再進入到細胞核內發揮基因調節的作用[14]。TGF-β1基因能夠通過加快產生纖維的細胞被激活，增強相關基因的表現，促進細胞增殖、分化；其次，還可通過對腎小球細胞進行損害，導致腎小球細胞逐漸纖維化[15]。在本研究中根據采用實時定量PCR法(RT-qPCR)對人體尿液中的纖維化基因表達情況進行判斷，測量TGF-β1和CTGF的mRNA的表達水平。結果顯示研究組患者尿液中的TGF-β1mRNA的表達水平明顯高于對照組(P＜0.05)；研究組B組2型糖尿病腎病患者尿液中的TGF-β1的mRNA的表達水平明顯高于研究組A組早期糖尿病腎病患者尿液中TGF-β1的mRNA的表達水平(P＜0.05)?；颊吣蛲饷隗w中TGF-β1的mRNA的表達水平與患者糖尿病腎病的嚴重程度呈正相關?？梢娫谔悄虿∧I病早期疾病中患者的TGF-β1水平就已經開始提高，且隨著TGF-β1基因表達水平的提高，患者的糖尿病腎病病情加重[7]。

而CTGF是TGF-β1的下游細胞因子，是由腎小球上皮、間質成纖維細胞生成，具有調節細胞纖維化的功效。CTGF具有調節TGF-β基因表達的能力，進而使得細胞纖維化加重。同時CTGF可促進KLF10的生成，進而將Smad7的生成進行抑制，進而導致Smad7對TGF-β/Smad信號通路的抑制作用下降[16]。同時CTGF基因表達的水平提示患者腎臟的受損嚴重程度[17]。在本研究中CTGF的mRNA的表達水平明顯高于對照組(P＜0.05)；研究組B組2型糖尿病腎病患者尿液中的CTGF的mRNA的表達水平明顯高于研究組A組早期糖尿病腎病患者尿液中CTGF的mRNA的表 達水 平(P＜0.05)。患者 尿外 泌體中CTGF的mRNA的表達水平與患者糖尿病腎病的嚴重程度呈正相關?？梢奀TGF可作為診斷早期糖尿病腎病的指標[18]。

本研究中，研究組A組患者的血肌酐、尿白蛋白、尿鈉的水平明顯高于對照組(P＜0.05)；2型糖尿病腎病B組患者的血肌酐、尿白蛋白、尿鈉水平更高于早期糖尿病腎病研究組A組患者(P＜0.05)。提示患者糖尿病腎病越嚴重血肌酐、尿白蛋白、尿鈉的水平越高；在早期糖尿病腎病級別方面，患者尿外泌體中致纖維化基因表達越多，腎病病變越嚴重，可見患者糖尿病腎病越嚴重，患者血肌酐、尿白蛋白、尿鈉的水平越高。同時患者尿外泌體中TGF-β1和CTGF的mRNA的表達水平能夠反應出患者糖尿病腎病的情況。

綜上所述，隨著早期糖尿病腎病患者的疾病嚴重程度的增加，患者尿外泌體中TGF-β1和CTGF的mRNA表達水平越高。糖尿病腎病患者尿外泌體中致纖維化基因TGF-β1和CTGF可能是臨床診斷早期糖尿病腎病及其進展的重要輔助生物學標志物。