基于氣載微流控芯片的作物病害孢子流式動態檢測方法

楊 寧 張素亮 王亞飛 袁壽其 毛罕平 張曉東

(1.江蘇大學電氣信息工程學院， 鎮江 212013； 2.江蘇大學農業工程學院， 鎮江 212013；3.江蘇大學流體機械工程技術研究中心， 鎮江 212013)

0 引言

據聯合國糧農組織最新統計，每年因作物病害造成的糧食損失量約占總產量的10%[1]，作物病害的監測與預防對于減少糧食損失尤為重要。作物真菌病害主要由空氣中的真菌孢子侵染引起[2-4]，因此，對空氣中病害孢子的監測成為近年來的研究熱點[5]。

當前真菌孢子檢測的傳統方法主要有平板菌落計數法、分子生物學檢測法、微懸臂梁檢測法和顯微圖像法。如MATIC等[6]、CHEONG[7]用眼觀察平板中菌落與背景的差異來識別平板中的菌落，并借助菌落計數器實現平板中的菌落準確計數。ALICIA等[8]用PCR技術實現了梭菌孢子生存能力的快速檢測。NUGAEVA等[9]利用鍍金和未涂覆的硅微機械懸臂陣列快速定量檢測黑曲霉和釀酒酵母的濃度。李小龍等[10]、齊龍等[11]利用形態學鑒定的方法對捕捉的孢子實現準確計數。姜玉英等[12]將自動對焦顯微鏡集成到孢子捕捉儀上實現孢子捕捉數量的大概統計。雷雨等[13]提出基于改進CenterNet孢子自動檢測方法，該方法能夠精準檢測并分割圖像中的孢子。以上方法雖能對病害孢子進行有效檢測，但平板計數法存在操作繁瑣、檢測時間長、具有一定的主觀性等問題[14]；分子生物學檢測法存在需要特異性抗體且需專業人員操作的問題[15]；微懸臂梁檢測法存在對檢測環境要求嚴格，難以適應復雜環境條件的問題[16]；顯微圖像法存在工作量大、誤差大、自動化程度低的問題[17]。目前，病害孢子在線檢測主要是孢子捕捉儀[18]，如托普云農智能孢子捕捉儀，該設備將孢子捕捉與顯微識別相結合，一定程度上實現了孢子在線檢測，但該方法需借助高精度顯微鏡進行輔助檢測，無法推廣實施。

隨著微納米技術加工工藝的發展，基于微流控芯片的微生物傳感器檢測系統因其具有集成度高、成本低、高通量、光學性能好等優點成為當前研究熱點[19-23]。微流控芯片雖在一定程度上解決了檢測效率低和便捷性差的問題[24-28]，但上述實驗液體中粒子分離芯片大多為一次性微流控芯片，易造成資源浪費；氣體中粒子分離主要基于微環境慣性原理，不同質量粒子隨氣流運動到芯片固定位置，之后在固定位置檢測粒子，這易造成芯片結構設計過于復雜，氣動式芯片使用一次后，固定位置粒子不易清理，易導致芯片復用率不高的問題。

基于此，提出一種基于氣載微流控芯片的作物病害孢子流式動態檢測方法，無需將孢子運動到芯片固定位置進行檢測。通過設計一種平行雙鞘流聚焦的微流控芯片，實現孢子的聚焦流動；利用光路聚焦原理和雙向Mie散射原理設計光電檢測結構；將微流控芯片和光電檢測結構組合搭建光電檢測系統，實現稻曲病孢子動態檢測，以解決微流控芯片孢子檢測復用率低的問題。

1 檢測原理與系統構成

1.1 實驗材料

實驗所用稻曲病孢子來源于中國水稻研究所實驗室，聚苯乙烯微球樣本購自天津大鵝科技有限公司。制備稻曲病孢子(7～9 μm)和聚苯乙烯微球(4 μm)樣本溶液，其菌體濃度和質量濃度分別為4.08×108個/mL和0.625 mg/mL。實驗利用氣溶膠發生器將稻曲病孢子和聚苯乙烯微球樣本制作成氣溶膠粒子，均勻釋放在1 L的容器中。實驗采樣時間為60 s，分別取20 mL溶液進行實驗。

1.2 微流控芯片結構設計

為實現微流控光電檢測系統的聚焦和檢測，設計的微流控芯片由進樣通道、鞘流通道、分壓通道、檢測通道和圓形腔室微結構組成(圖1)。其中：芯片通道高度為70 μm；芯片進樣接口用于真菌孢子進樣，直徑為500 μm；為實現孢子在芯片中心排成一列，設計平行雙鞘流結構，鞘流聚焦通道寬500 μm；為實現粒子減速進入檢測區，設計分壓通道結構，且分壓通道寬度為700 μm；為實現光電檢測系統檢測，粒子經過檢測區被激光激發發生前向和側向散色光，芯片檢測區寬度為350 μm；為實現粒子準確富集在富集區表面，設置圓形腔室結構，且圓形腔室直徑為2 500 μm。

圖1 微流控芯片Fig.1 Microfluidic chip1.進樣通道 2、3.鞘流通道 4.芯片檢測區 5、6.分壓通道 7.富集區 8.芯片出口

1.3 工作原理

1.3.1粒子聚焦原理

樣品在通道內在鞘流的擠壓下有明顯的聚焦區，區域寬度d小于初始進口寬度D2。如圖2所示，通過控制聚焦流的大小，可以讓微球逐個單獨通過聚焦區。樣品流的狀態是從寬的入口形態變成一條細的聚焦線狀態。

圖2 粒子聚焦示意圖Fig.2 Schematic of particle focusing

由質量守恒定律可知，同時通過中心處的流體質量和聚焦流中通過的流體質量相等，即

v2D2=vcd

(1)

式中D2、d——樣品流和聚焦流寬度，μm

v2、vc——樣品流和聚焦流流速，mL/min

微觀狀態的流體處于層流狀態，因此一些宏觀流體的性質，如樣品聚焦流體和鞘氣之間的物質擴散、混合等被忽略。根據這樣的假設和質量守恒定律，可得

(2)

式中D1、D3——兩個鞘氣通道寬度，μm

v1、v3——鞘氣流速，mL/min

va——在出口Da處的流體平均速度，mL/min

ρ1、ρ2、ρ3——對應3個入口通道內部流體密度，kg/m3

Da——芯片檢測區通道寬度

ρa——整個氣體出口處所有流體平均密度，kg/m3

假設此時，在通道出口處的微觀流體是完全的層流狀態，則在Da處的流速剖面呈拋物線分布，則

vc=vmax=1.5va

(3)

通過推導可知，流體聚焦后的寬度可表示為[29]

(4)

式(4)可以用來預測聚焦流的寬度，聚焦流的寬度隨著鞘氣流和樣品流的速度比上升而下降。

1.3.2激光散射基本原理

當粒子粒徑接近或大于入射光波長時稱為Mie散射現象，Mie散射適用于較大的粒子散射，一束波長為λ的激光照射到與其相距l的一個顆粒時，該粒子產生的散射光強為Is,其運算關系為[30]

(5)

其中

(6)

α=2rTn=θ

式中I0——入射光強，cd/m2

l——激光與散射體的距離，mm

θ——散射角，(°)

i1、i2——在垂直和水平方向散射光強度函數

α——粒子尺度參數

r——粒子半徑，μm

F——粒子相對復振幅函數

Πn——角散射系數

an、bn——米氏散射系數

1.4 系統結構

系統檢測平臺如圖3所示。實驗所涉及的設備主要包括532 nm半導體激光器(深圳市華上激光科技有限公司)、微流控芯片、微型氣泵、流量計、電路板、聚焦光路裝置等。

圖3 系統檢測平臺Fig.3 System testing platform1.電路板 2.微流控芯片 3.樣本 4.光電二極管 5.聚焦光路結構 6.半導體激光器 7.光源 8.半凸透鏡(焦距14 mm) 9.孔徑10 μm光闌面

系統的激發光源由532 nm半導體激光器和一個聚焦光路裝置組成，聚焦光路裝置為將光源聚焦到實驗所需要的光斑直徑(10 μm)，聚焦光路裝置由濾光片、焦距為14 mm半透鏡和小孔直徑為10 μm光闌面組成。激發光源經過聚焦光路結構對流經微流控芯片中的粒子進行激發，激發后的信號分別被前向和側向的光電二極管(S8745-01型)采集。實驗將通量為2.5 mL/min的微型氣泵連接到氣溶膠發生器出氣口，為微流控芯片收集稻曲病孢子提供進樣動力。為防止外界光進入檢測系統造成實驗誤差，整個檢測過程始終在暗室環境下進行。

2 微流控芯片仿真與優化

使用SolidWorks對微流控芯片的通道結構進行設計，并將設計圖導入COMSOL Mutiphysics 5.1軟件中，利用層流模塊和粒子追蹤模塊對粒子的運動軌跡進行仿真。由于系統檢測光斑直徑為10 μm，粒子聚焦寬度需優化到10 μm以內才能滿足系統檢測需求。研究粒子到達聚焦區域的坐標，記錄粒子經過的最高點和最低點，計算兩者的差值，將其作為聚焦寬度。經仿真發現粒子聚焦寬度受鞘流入口流速和芯片檢測區寬度影響較大。分別對鞘流入口流速和芯片檢測區通道寬度進行優化，保持樣品入口流速恒為2.5 mL/min，鞘流入口流速分別調整為6、9、12、15 mL/min，保持鞘流入口速度為恒定值，芯片檢測區寬度分別設置為250、300、350、400 μm。粒子聚焦寬度仿真優化結果如圖4所示。

圖4 粒子聚焦寬度仿真優化結果Fig.4 Particle focus width simulation optimization results

當鞘流流速分別為12、15 mL/min時，所對應芯片檢測區通道寬度為250、300、350 μm的粒子聚焦程度較好。考慮到芯片為PDMS軟膜制作，流速大易造成芯片通道變形，因此選擇12 mL/min作為最佳鞘流流速。由于芯片加工尺寸越小制作工藝就越復雜，綜合考慮成本及聚焦效果，將芯片檢測區寬度設計為350 μm，此時粒子聚焦寬度為8 μm，滿足系統檢測需求。

為更好地篩選出芯片富集區最佳直徑，將富集區直徑設置為1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 μm進行優化。通過仿真計算芯片富集效率，富集效率計算公式為

(7)

式中n——富集區收集到的粒子數

m——一次釋放粒子數

從圖5可知，當富集區直徑為2 500 μm時，富集芯片富集率可達96.7%(釋放300個粒子，芯片富集290個粒子)，最終將富集區直徑優化為2 500 μm。

對結構參數優化后的微流控芯片進行仿真，結果如圖6所示。聚焦檢測通道的速度為1 500 mm/s。

圖5 不同直徑下富集效率Fig.5 Enrichment efficiency under different diameters

圖6 粒子在芯片內運動仿真分析Fig.6 Simulation analysis of particle motion in chip

由圖6可知，富集區兩側的速度較大，當空氣中的粒子運動到富集區時，粒子速度變慢便停留在此區域，M型通道設計的作用主要實現降壓，以滿足粒子更好的聚焦。

3 前向散射信號分析

根據Mie散射理論可知，當粒子流經芯片檢測區時因受到聚焦光斑的照射而產生散射光，散射光主要分為前向散射和側向90°散射光，前向散射光強表征粒徑。實驗分別配置20 mL的聚苯乙烯微球(4 μm)、稻曲孢子(7～9 μm)和兩種粒子混合溶液。分3次將3種溶液放入氣溶膠發生器中，接著往氣溶膠發生器中通入氣壓為2.02×105Pa的氣流，對溶液中的粒子進行霧化操作，并在生物氣溶膠后接干燥管以除去氣溶膠流中的水分。最后，利用氣泵將霧化好的氣溶膠粒子以2.5 mL/min吸入微流控芯片進樣口進行光電檢測，在暗室條件下運行60 s。結果如圖7所示，圖7a為4 μm聚苯乙烯微球溶液脈沖圖，圖7b為孢子溶液脈沖圖，圖7c為兩種粒徑混合溶液脈沖圖，圖7d為粒徑和光強降低量關系圖。由圖7d可知，前向散射光強降低量與粒徑成正相關，下降幅度越大被檢測到的粒子直徑也就越大，決定系數可達0.966 6。因此，根據前向散射光強降低量即可計算出被檢測的粒子粒徑。

圖7 粒徑與光強關系分析Fig.7 Relative analysis of particle size and light intensity

4 粒子分類與計數結果分析

用聚苯乙烯微球和稻曲病孢子進行混合測試，系統每次工作60 s。圖8a為一組采集到的前向和側向散射光強信息，由圖8a可知，系統前向散射光強噪聲主要集中在2 120～2 180 cd/m2之間，聚苯乙烯微球光強下降至1 980～2 010 cd/m2，稻曲病孢子光強下降至1 915～1 950 cd/m2。系統側向散射光強噪聲主要集中在33～50 cd/m2之間，聚苯乙烯微球的側向光強信息集中在70～80 cd/m2之間，稻曲病孢子側向光強信息集中在90～105 cd/m2。圖8b為一組前向和側向散射光強信息散點圖，通過融合前向與側向散射光強信息，實現了稻曲病孢子和聚苯乙烯微球的分類。

圖8 混合測試結果Fig.8 Mixed test results

另外，為驗證系統的準確性，本研究探測器的計數結果與富集區粒子計數結果進行對比，共進行7組實驗，并統計系統的檢測誤差，誤差公式定義為

(8)

式中M——系統利用光強信息計算流經芯片檢測區的孢子和聚苯乙烯微球的數量

N——芯片富集區顯微鏡觀察孢子和聚苯乙烯微球數量

光散射計數與芯片富集區粒子計數對比結果如表1所示，最大誤差不超過12%，平均誤差為7.04%，而文獻[31]孢子檢測方案平均誤差為16.64%，精度提高了9.6個百分點，且光散射計數與富集區計數高度線性相關(決定系數R2為0.94)。測試結果表明，基于氣載微流控芯片的作物病害孢子流式動態檢測系統可用于檢測和識別稻曲病孢子。

5 芯片復用率分析

將本研究提出的平行雙鞘流聚焦的微流控芯片與文獻[27]中的富集式微流控芯片以及孢子捕捉儀普通載玻片的復用率進行對比。針對文獻[27]設計的富集式微流控芯片，實驗后均用氣泵將芯片內雜質抽空，但因芯片結構復雜仍有雜質存于微流控芯片中，在孢子濃度為4.2×105個/mL下工作2 min，芯片復用次數超3次就難以繼續使用。孢子捕捉儀富集孢子是采用涂抹凡士林的載玻片，不易清洗，玻片正常使用1次就需更換[32]。本文提出的聚焦式微流控芯片是一種流式動態檢測，經實驗測試得出，當連續使用超過31次，由于芯片材料是PDMS軟膜，芯片通道不斷有氣流流過，導致芯片通道發生變形，使實驗數據不準確，因此芯片使用次數在31次以內結果較為準確。3種芯片復用率如表2所示，由表2可知，本研究提出的芯片復用次數相比于文獻[27]提高約9倍。因此本文方法可有效解決微流控芯片復用率低的問題。

表1 光散射計數和富集區粒子計數結果Tab.1 Results of light scattering count and particle count in enriched region

表2 不同檢測方法復用率Tab.2 Comparison of different detection methods

6 結論

(1)提出一種基于氣載微流控芯片的作物病害孢子流式動態檢測方法，設計平行雙鞘流聚焦的微流控芯片,實現孢子動態檢測。

(2)對芯片通道尺寸及進氣速度進行優化，樣品入口流速為2.5 mL/min、鞘流速度為12 mL/min時粒子聚焦寬度可達8 μm、富集效率達96.7%。

(3)根據前向散射光強信息建立粒徑與光強的檢測模型，決定系數為0.966 6，具有較好的線性度。

(4)融合前向與側向散射光強信息，實現稻曲病孢子和聚苯乙烯微球的分類，平均檢測誤差為7.04%。

(5)芯片復用次數最多為31次，復用率提高約9倍。基于一種微流控芯片的氣體流式稻曲病孢子光電檢測方法有效解決了微流控芯片復用問題并為病害預警裝置研發提供了理論基礎。