普通白菜CYP同源基因克隆與表達分析

侯瑞澤，侯玉翔，許小勇,李 璿，李梅蘭

(山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801)

普通白菜(Brassicarapassp.chinensisMakino)又稱小白菜，屬于十字花科蕓薹屬，具有味道優美、營養價值高、物美價廉等特點，因而受到人們的廣泛關注，是我國重要的一種經濟蔬菜[1-2]。植物開花是高等植物生長發育中的一個重要過程，意味著植物由營養生長轉變為生殖生長[3]。這一過程受植物自身的遺傳因子、發育狀態、生理信號及外界環境因素的精確調控，是植物響應多種內在及外界環境的信號并整合的結果。正是這種內外因子協同調控的方式，能確保植物在最適合的時間開花，為后續植物生殖生長創造了良好的發育條件[4]。近年來有大量研究結果表明，植物有6條主要的開花調控路徑，包括光周期途徑[5]、春化途徑[6]、環境溫度途徑[7]、赤霉素途徑[8]、自主途徑[9]、年齡途徑[10]。植物激素是植物體內重要的活性信號分子，參與植物生長發育及細胞分化的調控過程。傳統的開花素學說認為，成花素和赤霉素可作為開花素調控植物的開花過程，表明在成花過程中，植物激素的作用不可或缺。目前主要的5種植物激素中，生長素對于成花作用也有著至關重要的作用[11-13]。正是內外各方面因素的影響，交織形成了植物豐富且特殊的開花調控網絡。

根據生長素代謝的相關報道[14-15]，生長素的合成分為依賴色氨酸和非依賴色氨酸2種途徑，依賴性途徑又劃分為4條支路，其中，吲哚乙醛肟(IAOx)途徑是十字花科植物中最重要的一條途徑，在擬南芥中對吲哚-3-乙酸 (Indole-3-acetic acid，IAA)合成起到輔助作用，且IAOx是IAA和次生代謝物，包括吲哚族硫苷(Glucosinolates)、蕓薹葡糖硫苷(Glucobrassicin，GB)和植保素(Camalexin)的共同前體。且因在擬南芥中CYP79B蛋白是催化生長素合成反應中的主要酶，故該途徑又稱為CYP79B途徑。

CYP79B2酶是十字花科植物IAA合成過程中的重要物質，其可通過催化生成IAOx進入吲哚族硫苷和IAA代謝途徑。前人研究表明[16]，CYP79B2基因的過表達會使植物體內IAA含量明顯提高，且參與色氨酸代謝的CYP79B2基因在1 μmol/L 2，4-D上生長的擬南芥中被誘導表達，導致吲哚族硫苷積累量增加，說明CYP79B2基因與IAA的代謝合成密切相關。目前，對于CYP79基因家族的研究多集中在硫代葡萄糖苷(簡稱硫苷)、生氰糖苷類和腈類的生物合成關鍵酶的表達調控，其中硫苷通常被視為十字花科植物中具有抗病蟲功能的重要次生代謝物。且有研究報道表明[17-18]，CYP基因家族在不同物種中的表達模式存在差異[19-20]，對于CYP79B2基因與IAA合成的分子機制也僅在擬南芥、大白菜等植物中得以研究。因此，可以將普通白菜作為研究對象，以IAA代謝的前體物吲哚乙醛肟為切入點，闡明CYP79B2基因與IAA的合成代謝模式，為十字花科植物生長發育調控及其對開花機理研究提供依據。

本試驗以75#普通白菜為材料，通過RT-PCR方法克隆普通白菜擬南芥CYP79B2的同源基因，利用生物信息學方法對其序列及蛋白結構進行分析，并通過熒光定量實時PCR對基因BrcCYP79B2-1不同組織器官和發育時期的表達進行分析，旨在為后續對普通白菜的開花調控及病蟲防治機理研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為普通白菜品系75#，該品系在適宜環境下種子露白后，4 ℃低溫處理20 d即可完成春化，春化結束后移栽到穴盤中，并分別對移栽后0，10，15，16 d的植物組織莖尖進行取樣，樣品分別標記為V0、V10、V15、V16。取樣質量為0.1 g，液氮速凍后于-80 ℃凍存備用。

1.2 總RNA提取及cDNA第1鏈的合成

將移栽10 d的植物組織莖尖樣品在液氮中迅速研磨成粉末后，按照RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN，DP432)試劑盒提取RNA，并凍存于-80 ℃冰箱。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa，RR037Q)試劑盒將其反轉錄成第1條cDNA，作為克隆基因所需要的模板。

1.3 BrcCYP79B2-1的基因克隆

利用大白菜數據庫(http：//brassicadb.org)查找BrcCYP79B2-1的序列，用Primer 5.0在線軟件對基因設計克隆引物，序列為F：ATGAACACTCTTACC

TCAAACTCTTCG；R：CTACTTCACCGTCGGGTAAAGA。以1.2獲取的cDNA為模板，使用TaKaRa LA Taq?(TaKaRa：RR02MQ)試劑進行PCR擴增，其反應體系為(共50 μL)：TaKaRa LATaq0.5 μL，LATaqBuffer Ⅱ(10×)5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)8 μL，正、反引物(10 μmol/L)以及cDNA模板各1 μL，無菌水33.5 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；最后72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物，確認條帶大小正確且無雜帶后進行膠回收。

將膠回收的DNA產物用pUCm-T Vector PCR Products Cloning Kit(Sangon Biotech，B522213)在PCR儀中與T-載體連接12 h。后轉化至大腸桿菌DH5α Competent Cells中，挑選陽性克隆進行PCR，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4 生物信息學分析

使用DNAMAN軟件對測序序列翻譯成氨基酸，以NCBI數據庫為基礎，進行氨基酸序列多重比對，并構建系統進化樹。然后采用在線工具Protparam分析氨基酸的理化性質。

1.5 基因的表達分析

為了更清楚地了解BrcCYP79B2-1的功能，將普通白菜75#品系的根、莖、葉、花蕾和果莢進行取樣，用qRT-PCR的方法研究基因在不同器官中的表達情況。BrcCYP79B2-1的特異性引物序列為F：CTCCGTGAAGCTTTCCGTCT；R：AACTTTTGGGTTACGGCCCA。

2 結果與分析

2.1 基因BrcCYP79B2-1的克隆和序列分析

經瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR擴增產物，結果發現，目的條帶大小與實際大小一致(圖1)，可進行后續的測序，由測序結果可知，BrcCYP79B2-1片段大小為1 623 bp。

M.DNA Marker；1—3.BrcCYP79B2-1。

使用DNAMAN軟件對BrcCYP79B2-1進行蛋白質翻譯，結果表明，BrcCYP79B2-1共編碼540個氨基酸(圖2)。

圖2 BrcCYP79B2-1基因及氨基酸序列Fig.2 Gene and amino acid sequence of BrcCYP79B2-1

對BrcCYP79B2-1編碼蛋白質的理化分析結果表明，推測分子質量為60.849 73 ku，其理論等電點為8.71，脂肪指數為86.33，親水性的平均值是-0.174；帶負電荷的殘基總數是58，帶正電荷的殘基總數為64，不穩定性指數(Ⅱ)為35.30，此蛋白質分類也是穩定的。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 氨基酸多重序列比對 利用DNAMAN軟件對BrcCYP79B2-1基因的氨基酸序列同相近的物種進行多重比對，結果表明，克隆基因BrcCYP79B2-1氨基酸序列同大白菜(Brassicapekinensis)、甘藍型油菜(Brassicanapus)、甘藍(Brassicaoleraceavar.capitata)、蕪菁(Brassicarapa)、花椰菜(Brassicaoleraceavar.botrytis)、蘿卜(Raphanussativus)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)具有較高的同源性，同源性分別達到98.70%，98.89%，98.52%，99.52%，98.33%，96.85%，93.16%(圖3)。

圖3 BrcCYP79B2-1的氨基酸序列多重比對結果Fig.3 Multiple alignment results of the amino acid sequence of BrcCYP79B2-1

2.2.2 蛋白質親緣關系分析 為了進一步了解BrcCYP79B2-1編碼蛋白與其同源蛋白在不同植物之間的進化關系，使用DNAMAN軟件構建這2個蛋白在不同植物物種間的系統進化樹，結果表明，與BrcCYP79B2-1編碼蛋白親緣關系最近的是甘藍型油菜同源蛋白，并且同大白菜、花椰菜和蕪菁屬于一個小分支；與蘿卜和擬南芥親緣關系較近，與茶花(Camelliasinensis)、胡楊(Populuseuphratica)、黃麻(Corchoruscapsularis)等植物的親緣關系較遠(圖4)。

圖4 BrcCYP79B2-1同源蛋白的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of BrcCYP79B2-1 homologous protein

2.2.3 蛋白質結構預測結果 使用SOPMA預測蛋白質的二級結構，結果顯示(圖5)，BrcCYP79B2-1編碼蛋白的主要二級結構是α-螺旋(47.41%)和無規則卷曲(37.04%)。使用Swissmodel預測蛋白質的三級結構如圖6所示，其三級結構模型與二級結構分析結果吻合。

圖5 BrcCYP79B2-1蛋白質二級結構預測Fig.5 Protein secondary structure of BrcCYP79B2-1

圖6 BrcCYP79B2-1蛋白質三級結構預測Fig.6 Protein tertiary structure prediction of BrcCYP79B2-1

2.3 基因表達分析結果

為了了解BrcCYP79B2-1在普通白菜不同器官與不同生育期中的表達情況，使用qRT-PCR的方法對其進行定量分析，結果發現(圖7)，BrcCYP79B2-1基因在植物花蕾中的表達量最低，在莖中的表達量較低，在葉片中的表達量較高，而在根中的表達量最高。

不同小寫字母代表相對表達量在0.05水平上差異顯著。Different lowercase letters represent significant differences in relative expression at the 0.05 level.

從圖8可以看出，經過低溫處理后，莖尖部位該基因的表達量都表現出先急劇上升，在移栽10 d后達到頂峰，而后逐漸下降，移栽15 d后處于相對較低的表達水平，有利于促進花芽分化。

圖8 BrcCYP79B2-1在不同發育時期莖尖部位的表達Fig.8 Expression of BrcCYP79B2-1 in shoot apex at different developmental

3 結論與討論

CYP79B(IAOx)途徑又稱吲哚乙醛肟途徑，是十字花科植物合成生長素的重要途徑[21]。吲哚-3-乙酸是十字花科植物生長發育的重要激素，而CYP79B2/B3基因催化生成的吲哚乙醛肟(IAOx)是這2條代謝途徑的前體物質[22-23]。有研究表明[24-25]，CYP79B2基因的過表達會導致植物體內IAA含量升高，而IAA含量的增加也會形成反饋，使得CYP79B2表達水平提高。且CYP79B2表達受病原體感染和機械損傷誘導，在根、葉和花中表達最高。本試驗通過實時熒光定量研究在普通白菜不同器官中的表達情況，這個基因在根和葉中表達量較高，這與前人的研究結果相符[26]。而根據在菘藍中克隆到的基因IiCYP79B2的表達分析表明[27]，其在不同組織中的表達量由高到低依次為葉>莖>果>花>根，這也說明CYP79B2基因在不同物種的表達存在明顯差異。另有研究表明[28]，CYP79B2/B3的表達主要集中在頂端分生組織、下胚軸、子葉葉脈、真葉葉脈、根和根尖，而這些都是生長素的主要合成和運輸部位，這也證實了其在十字花科植物生長素合成過程中的作用；研究還認為，CYP79B2/B3的表達可能與MYB轉錄因子有關，但還需進行進一步研究。

BrcCYP及其同源基因在花發育過程中起著重要的作用，普通白菜BrcCYP的同源基因所編碼的蛋白與十字花科蔬菜，如大白菜和蘿卜等具有較高的同源性，也進一步說明了十字花科蔬菜間較近的親緣關系。且近年來，越來越多的資料表明[29-31]，生長素對植物開花有著重要影響，如王小權等[32]研究認為，其內源因子與花序發育的內源因子有關。徐振朋等[33]研究認為，生長素與其他激素的平衡對于成花有著重要的調控作用。鄧全恩[34]研究認為，生長素可以調控油菜花的花期、開花樣式和花粉活力，并使花芽內部碳水化合物含量、激素含量、基因表達呈現與花器官發育進程一致的改變。這些都說明，生長素在成花過程中發揮了重要的作用。而不同低溫時間處理下，BrcCYP79B2-1的表達量有所不同，且有峰值，其表達對于低溫的響應，也將BrcCYP79B2-1的作用與植物開花調控關聯起來，為植物開花機制研究提供思路，也為后續功能驗證提供理論基礎。

本試驗通過研究CYP79B2同源基因BrcCYP79B2-1的表達模式及其生物學信息分析，結果顯示，該基因的表達與低溫春化有關，可以影響花芽分化。這對于研究十字花科植物生長發育調控機制具有重要意義。本研究以RT-PCR的方法從普通白菜中克隆到CYP79B2同源基因BrcCYP79B2-1，并通過與其他物種的同源蛋白進行序列多重比對和親緣關系分析，結果表明，克隆到的基因BrcCYP79B2-1的確是普通白菜中的CYP79B2同源基因。采用qRT-PCR的方法對普通白菜不同器官和時期BrcCYP79B2-1的表達量進行分析，結果發現，BrcCYP79B2-1在根中的表達量最高，葉中次之，而在花蕾中的表達量最低，在低溫處理10 d表達量最高。本試驗結果為后續研究十字花科植物開花機制的研究奠定了一定理論基礎。