亞麻主要產量相關性狀的SSR關聯分析

伊六喜，鄔 陽，曹 彥，賈海濱，斯欽巴特爾，高鳳云，周 宇，賈霄云

(1.內蒙古農業大學 農學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.烏蘭察布市農林科學研究院，內蒙古 集寧 012000；3.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031)

亞麻(LinumusitatissimumL.)是我國特色油料作物，一般分為油用亞麻(胡麻)和纖維亞麻[1]。主要分布于我國華北、西北地區。亞麻對不同自然環境的適應能力較強，適合種植于我國北方地區干旱寒冷的生態區域。亞麻籽富含亞麻酸、木酚素、亞麻膠、膳食纖維等豐富的營養成分，有益于人體健康，可以制成多種保健食品[2]。

亞麻種質產量相關性狀的表型鑒定及其關聯的SSR標記的挖掘，對亞麻高產育種具有重要意義。近年來，眾多學者以亞麻種質資源為研究對象，通過表型鑒定分析了亞麻產量相關性狀的遺傳變異。歐巧明等[3]對336 份油用亞麻種質資源的6個主要農藝性狀進行鑒定與評價，篩選出10份株高適中，單株分莖、分枝能力強，單株果數多，單株生產力高的品種。王利民等[4]應用主基因+多基因混合遺傳分離分析方法，研究了單株產量、單株果數、千粒質量和每果粒數4個性狀的遺傳效應，結果表明，單株產量、單株果數、千粒質量的遺傳效應相同。陳英[5]對 341 份亞麻種質資源的 11 個數量性狀進行多元統計分析，發現亞麻分枝數的變異系數最大，成熟日數的變異系數最小。李秋芝等[6]通過亞麻核心種質農藝性狀的遺傳多樣性分析，篩選出20份表現型較理想的資源材料。鄧欣等[7]對535份亞麻材料的表型進行鑒定與評價，結果表明，亞麻種子產量與分枝數、分枝習性、單株莖質量、蒴果數、莖粗、分莖數、全生育日數、千粒質量呈正相關，與工藝長度、出麻率及開花日數呈負相關。

開發亞麻產量相關性狀緊密連鎖的遺傳標記，對亞麻育種縮短周期、提高效率以及精準選育具有重要意義。產量相關性狀易受環境影響，屬于數量性狀。關聯分析是快速、準確定位目標性狀基因的重要方法，是開發實用性分子標記的主要手段。Cloutier等[8]用30份EST-SSR引物對23份亞麻種質進行了遺傳多樣性分析。Wu等[9]采用簡化基因組測序技術，在亞麻中開發出1 574個SSR標記。 Choudhary等[10]利用22個SSR標記的270個多態性位點與130份亞麻種質的26個表型性狀進行關聯分析，獲得了95個顯著關聯位點。這些結果對亞麻種質SSR標記研究提供基礎。

內蒙古自治區農牧業科學院胡麻課題組前期研究中通過對401份亞麻種質的表型和SRAP標記的評價，構建了229份亞麻核心種質的自然群體，在此基礎上，本研究利用30對SSR引物對該核心群體進行基因型檢測，旨在挖掘產量相關性狀緊密關聯的SSR標記，為亞麻遺傳改良提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為229份亞麻核心種質，其中110份為國內種質，分別來自6個亞麻主產區(內蒙古占10%、甘肅占18%、河北占6%、山西占6%、寧夏占5%、新疆占3%)，119份為國外種質，分別來自9個國家(美國占9%、荷蘭占8%、匈牙利占8%、加拿大占7%、法國占5%、巴基斯坦占5%、阿根廷占3%、伊朗占3%、俄羅斯占3%)。

1.2 產量相關性狀的測定與分析

229份亞麻種質分別種植于內蒙古呼和浩特市(Hohhot，HS)、集寧區(Jining，JN)、錫林郭勒盟太仆寺旗(Ximeng，XM)、新疆伊犁州(Xinjiang，XJ)4 個亞麻主產區，田間播種均采用隨機區組設計， 3次重復，每份種質材料種植3行，行長 2. 0 m，行距0. 20 m，每行種子180粒。4個地區的地理位置、物候條件、播種和收獲時期見表1。苗期，取2.00 g新鮮嫩葉于-80 ℃冰箱保存備用。亞麻生理成熟后，試驗小區隨機取樣 20 株，參照《亞麻種質資源描述規范和數據標準》[11]，測定株高、工藝長度、單株果數、每果粒數、單株粒質量、種子千粒質量、分枝數等性狀。

表1 4個種植區的地理位置、氣候條件Tab.1 Geographical location and climatic conditions of the 4 growing areas

1.3 亞麻SSR-PCR擴增

樣品基因組DNA提取參照Stewart等[12]提出的CTAB法，檢測合格之后于-20 ℃保存備用。利用本課題組前期篩選獲得的30對SSR引物(表2)，送上海生工生物工程技術服務有限公司合成，PCR 反應體系和擴增程序與伊六喜等[13]優化程序一致。擴增產物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒功率70 W電泳1.5 h，采用銀染法顯色[14]。DNA Marker(1500)條帶為對照標記種質之間基因型差異條帶，標記為“0”或“1”，組成一個“1”和“0”的數據矩陣[15]。用POPGEN 1.32計算有效等位基因數、引物多態性信息含量[16]；用TASSEL 5.0對表型數據和SSR分子標記數據進行廣義線性模型(General linear model，GLM)和混合線性模型(MLM)的關聯分析，得出P值、表型變異解釋率、關聯位點以及表型效應值數據。

表2 30對引物序列 Tab.2 Primer sequences of 30 pairs

2 結果與分析

2.1 亞麻產量相關性狀的統計分析

7個產量相關性狀的統計分析結果表明，在4個環境下，株高平均值為(56.80±6.22)cm，其中呼和浩特地區平均值最大，為(58.40±5.67)cm；工藝長度平均值為(20.93±6.53)cm，其中新疆地區的平均值最大，為(22.30±6.90)cm；分枝數平均值為(4.63±1.03)個，其中集寧地區的平均值最大，為(5.00±1.25)個；單株果數平均值為(16.31±5.04)個，其中呼和浩特地區的平均值最大，為(17.50±3.50)個；果粒數平均值為(6.22±2.07)粒，其中集寧地區的平均值最大，為(6.52±2.67)粒；千粒質量平均值為(5.42±1.69)g，其中集寧地區的平均值最大，為(5.58±1.48)g；單株粒質量平均值為(0.52±0.20)g，其中呼和浩特地區平均值最大(0.55±0.15)g。7個產量相關性狀的4個環境下的平均變異系數為11.18%～18.29%，其中分枝數變異系數最小(11.18%)，單株粒質量的變異系數最大(18.29%)。在4個環境下千粒質量的廣義遺傳力最大(63.25%)，工藝長度的廣義遺傳力最小(48.85%)，7個產量相關性狀的廣義遺傳力從大到小依次為千粒質量>果粒數>單株粒質量>株高>單株果數>分枝數>工藝長度(表3)。對7個產量相關性狀的正態分布檢驗結果表明，所有性狀基本呈現正態分布的趨勢(圖1)，說明亞麻株高、工藝長度、單株果數、果粒數、單株粒質量、千粒質量、分枝數主要由基因型控制。

表3 不同環境下7個亞麻產量相關性狀的統計分析Tab.3 Statistical analysis of 7 yield-related traits in different environments

圖1 229份亞麻品質(系)的7個產量相關性狀的頻率直方圖Fig.1 Frequency histogram of 7 yield-related traits in 229 flax germplasm

2.2 亞麻產量相關性狀的相關性分析

7個產量相關性狀之間的相關性分析結果表明，除了工藝長度和千粒質量、千粒質量和株高之間呈極顯著負相關，株高與工藝長度的相關系數最大，為0.863(表4)，說明亞麻株高和工藝長度是密切相關的2個性狀，在纖維亞麻中該特征更為明顯，此結果與前期對401份亞麻材料的表型分析結果一致[17]。亞麻單株粒質量、單株果數、果粒數和千粒質量是影響亞麻單株產量的主要性狀，本研究結果表明，亞麻單株粒質量與分枝數、單株果數和果粒數之間呈極顯著正相關，說明單株果數、果粒數和千粒質量的增多，可以提高單株粒質量，其是亞麻單產直接相關的因素。千粒質量與株高和工藝長度呈極顯著負相關(P<0.01)，該結果進一步說明了纖維亞麻和油用亞麻之間的表型差異，纖維亞麻株高較高，但種子籽粒較小，而油用亞麻株高較矮，但種子籽粒大。

表4 亞麻7個產量相關性狀間的相關性分析Tab.4 Correlation coefficient among 7 agronomic traits of flax

2.3 SSR引物多態性分析

由表5可知，利用30對SSR引物在229份亞麻材料中共擴增出365條條帶，平均每對引物擴增出12.17條條帶，其中Lu462引物擴增的條帶最多(19條)，多態性位點在5～19，有效等位基因數在1.199 1～ 1.832 0，引物多態性含量為0.248 9～0.625 7，其中Lua37引物的多態性含量最高，為0.625 7，其次為Lu422引物(0.611 7)，引物平均多態性含量為0.432 2。本試驗使用的SSR引物多態性好、條帶清晰，以Lu661引物在29份亞麻種質上擴增結果為例(圖2)。

表5 30對SSR引物在229份亞麻種質的擴增Tab.5 Amplification of 229 flax germplasm using 30 pairs of SSR primer

2.4 遺傳多樣性分析

將229份亞麻種質劃分為兩大類群，分別表示為A和B(圖3)，其中，A群包括116份亞麻種質，其中國內種質33份，國外種質83份。該群分為2個亞群，第1個亞群(A-Ⅰ)包括74份亞麻種質，其中國內種質20份(內蒙古9份、甘肅5份、寧夏2份、新疆2份、山西1份、河北1份)，占該亞群的27.02%；國外種質54份，占該亞群的72.98%。第2個亞群(A-Ⅱ)包括42份亞麻種質，其中國內種質13份(內蒙古8份、甘肅3份、河北1份、新疆1份)，占亞群的30.95%；國外種質29份，占該亞群的69.05%。B群包括113份亞麻種質，其中國內種質87份，國外種質26份。該群分為2個亞群，第1個亞群(B-Ⅰ)包括56份亞麻種質，其中國內種質45份，占該亞群的80.35%；國外種質11份(加拿大3份、美國2份、法國2份、巴基斯坦2份、西德1份、匈牙利1份)，占該亞群的19.64%。第2個亞群(B-Ⅱ)包括57份亞麻種質，其中國內種質42份，占該亞群的73.68%；國外種質15份(加拿大7份、美國3份、俄羅斯2份、匈牙利1份、法國1份、阿根廷1份)，占該亞群的26.32%。從A和B這2個大類群國內外種質占比來看，基本能區分開。

M.DL1500；1—29依次為29份亞麻樣品。M.DL1500；1—29 were 29 flax samples in turn.

圖3 229份亞麻種質的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 229 flax germplasm

對229份亞麻種質的群體結構分析結果顯示，當K=4時，ΔK的值出現顯著峰值(圖4)，因此，當K=4時，分為4個群體，第1個群、第2個群和第4群均為56份種質，第3群為61份種質(圖5)。

2.5 關聯分析

使用TASSEL 5.0軟件的廣義線性模型(GLM)和混合線性模型(MLM)程序，將每份種質的Q值作為協變量，對30個SSR標記分別與不同環境下檢測到表型數據均值進行關聯分析，檢測目標性狀顯著(P<0.01)關聯的標記。GLM和MLM的關聯分析結果分別見表6，7，GLM下檢測到了36個SSR標記，標記對性狀表型變異的解釋率為1.15%(Lu146)～7.75%(Lu747)，平均為4.19%；MLM下檢測到了23個SSR標記，標記對性狀表型變異的解釋率為2.26%(Lu203a)～7.16%(Lu291)，平均為3.62%。在GLM和MLM下，單株粒質量、單株果數和分枝數同時檢測到了Lu203a和Lua125a標記，分別分布在第12，2號染色體上。

圖4 ΔK隨K值的變化曲線Fig.4 ΔK with the change of K values

圖5 229份亞麻種質群體結構分析Fig.5 Analysis of population structure of 229 flax germplasm

表6 亞麻產量相關性狀的GLM關聯分析Tab.6 GLM correlation analysis of flax yield related traits

表6(續)

表7 亞麻產量相關性狀的MLM關聯分析Tab.7 MLM correlation analysis of flax yield related traits

3 結論與討論

亞麻是一種高度自花授粉作物，在高產育種技術上，仍沿用常規育種手段，能用的分子標記較少，導致育種周期長，選擇效率低，品種更新換代緩慢。因此，通過亞麻種質資源產量相關性狀的關聯分析，挖掘實用性分子標記對亞麻遺傳改良具有重要意義。關聯分析研究中，種質資源的表型鑒定評價是最關鍵的一步，利用本課題組前期構建的229份亞麻核心種質材料[18]，通過4個環境的表型鑒定分析結果表明，在呼和浩特地區種植的亞麻種質株高((58.40±5.67)cm)、單株果數((17.50±3.50)個)和單株粒質量((0.55±0.15)g)指標表現為最大；在集寧地區種植的亞麻種質分枝數((5.00±1.25)個)、果粒數((6.52±2.67)粒)和千粒質量((5.58±1.48)g)的指標表現為最大，說明不同種植環境對亞麻產量相關性狀的影響較大。7個產量相關性狀的變異系數為11.18%～18.29%，除千粒質量與株高和工藝長度呈極顯著負相關外，其他性狀之間相關性均為正相關。廣義遺傳力從大到小依次為千粒質量>果粒數>單株粒質量>株高>單株果數>分枝數>工藝度。基于SSR標記的遺傳多樣性分析結果表明，229份亞麻種質分為2個大群，國內外種質基本能區分開。此結果為亞麻種質資源收集保存和種質創新提供重要的參考信息。然而為了更好地服務亞麻育種，這些試驗結果還需要多年多點的大田試驗來進一步鑒定與評估。

近幾年，亞麻SSR標記開發研究報道較多[19-20]，但是這些成千上萬標記真正應用于亞麻育種當中的寥寥無幾，因此，亞麻種業發展需要更多種質資源的表型和基因型鑒定評價，并挖掘實用性分子標記。本研究篩選出30對SSR多態性引物，共擴增出365條條帶，與亞麻7個產量相關性狀進行關聯分析，GLM下檢測到了36個顯著關聯的SSR標記，MLM下檢測到了23個SSR標記。其中Lu203a和Lua125a標記在2種模型下均關聯到單株粒質量、單株果數和分枝數。通過亞麻參考基因組(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore?LinkName)的比對，Lu203a(CCTTTTCACGCAGAGCTACC/GCTTCCGTAATCCTCTTCCA)標記分布在12號染色體上，Lua125a(GCCTTTGGAGGGCTTAACTT/ACAATCCCAACATTCCCAAA)標記分布在2號染色體上。前人對亞麻種質的SSR標記研究中大量使用了這2個標記[21-24]，說明后期可以利用Lu203a和Lua125a標記輔助選擇對應的目標性狀，對亞麻遺傳改良提供便利。