北方冬麥區小麥春化基因的組成與分布及其與冬春性的關系

趙 杰，劉洪泉，趙 蕓，楊 鍇，3，傅永斌，顧玉章，孫麗靜，胡夢蕓，李 輝，張穎君

(1.河北省農林科學院 糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種實驗室，河北 石家莊 050035；2.河北宏瑞種業有限公司，河北 石家莊 050035；3.河北工程大學 園林與生態工程學院，河北 邯鄲 056038；4.張家口市農業科學院，河北 張家口 075000)

小麥春化作用是指經過適宜的低溫處理從而啟動或促進小麥開花的現象[1-2]。根據小麥春化過程中對低溫的需求強度和持續時間，將其劃分為強冬性、冬性、半冬性、弱冬性、弱春性和春性[3-4]。

小麥的春化作用主要由VRN1[5-6]、VRN2[7-8]、Vrn-B3[9]和Vrn-D4[10]基因控制。其中，VRN1位點包括Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D13個同源基因，分別位于小麥5A、5B、5D染色體上[11]，這3個同源基因中任意一個基因為顯性時，小麥的發育特性即為春性[12]，且顯性等位基因Vrn-A1的效應強于Vrn-B1和Vrn-D1[11]。VRN2位點位于小麥5A染色體[7]，該位點包括2個串聯重復的基因ZCCT1和ZCCT2[8，13]。VRN2可以調控VRN1和Vrn-B3的表達[9]。利用中國春的染色體置換系群體，在小麥7B染色體短臂上定位到控制春化作用的基因Vrn-B3[9]，該基因是擬南芥FLOWERINGLOCUST的同源基因，其顯性等位基因促進小麥開花，參與小麥春化途徑的支路[9]。Vrn-D4位于小麥5D染色體短臂上，通過與VRN1和Vrn-B3的互作參與調控小麥的春化進程[10]。研究表明，VRN1是小麥春化過程中的關鍵基因[14]，且對VRN2基因具有顯性上位作用[15]。當3個VRN1基因全為隱性，且VRN2為顯性等位基因時，小麥發育特性為春性[15]。

北方冬麥區由北部冬麥區和黃淮冬麥區組成，是我國小麥主產區[16-17]。北部冬麥區主要包括遼寧省南端、北京、天津、河北省長城以南與保定和滄州以北地區、山西省中部與東南部、陜西省北部和甘肅省隴東地區；黃淮冬麥區包括山東、河南、河北省中南部、陜西關中平原、山西省南部、甘肅省天水市及平涼與定西區域、江蘇和安徽省的淮河以北區域[18-19]。北方冬麥區約占全國小麥總產的75%左右[19]，保障該麥區的小麥產量對我國糧食生產起著至關重要的作用。

本研究以271份北部冬麥區和黃淮冬麥區小麥品種為試驗材料，研究4個主效春化基因Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和Vrn-B3的組成特點，闡明兩大冬麥區VRN基因組成與小麥冬春性的關系，旨在為小麥品種遺傳改良提供理論支撐，對小麥生產具有重要的指導意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究以北方冬麥區271份小麥主栽品種(包括北京14份、天津1份、河北79份、河南71份、山東57份、山西24份、陜西15份、甘肅1份、江蘇9份)為試驗材料進行4個春化基因的分子標記檢測。

1.2 小麥材料田間表型鑒定和冬春性確定

將這271份小麥品種于2020年12月初播種于河北省農林科學院糧油作物研究所三亞試驗站，2021年1月下旬調查記錄田間抽穗情況。當地氣溫數據于2345天氣預報網(http：//tianqi.2345.com/)進行查詢。同時，結合中國作物種質信息網(https：//www.cgris.net/)和《中國小麥遺傳資源目錄》的查詢結果確定檢測小麥材料的冬春性。

1.3 小麥基因組DNA提取和春化基因檢測

利用CTAB法提取小麥葉片基因組DNA。春化基因的序列特異性檢測參照Yan等[20]、Fu等[21]和Yan等[9]的方法。引物由通用生物系統(安徽)有限公司合成，引物序列見表1。序列擴增試劑采用康為世紀生物科技股份有限公司(https：//www.cwbio.com/home)的2×Es Taq MasterMix，PCR擴增程序如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，50～61 ℃退火30～60 s，72 ℃延伸1～2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物檢測利用1%或2%的瓊脂糖凝膠電泳，200 V電壓電泳30 min，緩沖體系為1×TAE溶液。

2 結果與分析

2.1 小麥品種VRN基因的顯隱性分析

2.1.1Vrn-A1基因檢測結果 利用引物VRN1AF和VRN1-INT1R對271份小麥品種的基因組DNA進行特異性擴增，結果顯示，所有品種均能擴增出734 bp的片段，表明這些品種不含Vrn-A1a或Vrn-A1b等位變異。進一步利用引物Intr1/A/F2和Intr1/A/R3對這些小麥品種的基因組DNA進行擴增，所有小麥品種均未擴增出目標條帶，而利用引物Intr1/C/F和Intr1/AB/R均可擴增出1 068 bp的特異性片段，推斷供試小麥品種中Vrn-A1第1內含子區域均不含大片段缺失，其Vrn-A1的基因型為隱性vrn-A1。由此表明，271份小麥品種只含有隱性基因vrn-A1。

表1 小麥春化基因檢測相關引物Tab.1 Primers used for detection of genes responding to vernalization of wheat

2.1.2Vrn-B1基因檢測結果 本研究利用引物組合Intr/B/F、Intr1/B/R3和Inr/B/F、Inr1/B/R4對271份小麥品種的Vrn-B1基因組成進行檢測。結果顯示，有8份品種(豫麥34、鄭麥9023、先麥10號、豐川6號、科信9號、陜253、陜農78和西農538)利用引物Intr/B/F和Intr1/B/R3可以擴增出709 bp片段，而引物Inr/B/F和Inr1/B/R4未擴增出目標條帶，表明這8份品種含有顯性基因Vrn-B1，占供試品種的3.0%。而其余小麥品種只有引物Inr/B/F和Inr1/B/R4可以擴增出1 149 bp片段，引物Intr/B/F和Intr1/B/R3未擴增出條帶，表明這些品種含有隱性基因vrn-B1(占97.0%)。

2.1.3Vrn-D1基因檢測結果 利用引物Intr/D/F和Intr1/D/R3對這271份小麥品種進行檢測，結果顯示，有75份小麥材料可以擴增出1 671 bp特異性條帶，而引物Intr/D/F和Intr1/D/R4未擴增出條帶，表明這些小麥品種含有顯性基因Vrn-D1(占27.7%)。其余的196份小麥材料檢測結果正好相反，表明這些材料含有隱性基因vrn-D1(占72.3%)。

2.1.4Vrn-B3基因檢測結果 對271份小麥材料Vrn-B3位點進行檢測，結果顯示，所有品種利用引物VRN4-B-INS-F和VRN4-B-INS-R均未擴增出目標條帶，而引物VRN-4-B-NOINS-F和VRN-4-B-NOINS-R都擴增出1 140 bp特異性條帶，表明這些材料均含有隱性基因vrn-B3。

2.2 小麥品種不同春化基因的組合和分布情況

通過分析供試小麥材料春化基因顯性位點的分布情況，表明顯性等位基因Vrn-D1分布頻率最高，為27.7%；顯性等位基因Vrn-B1分布頻率僅為3.0%；所檢測材料中均不含顯性等位基因Vrn-A1和Vrn-B3(表2)。以上結果表明，供試小麥品種中控制春化作用的顯性等位基因主要是Vrn-D1，其中在江蘇小麥品種中分布頻率最高(88.9%)，其次為河北小麥品種(38.0%)、陜西小麥品種(33.3%)、河南小麥品種(31.0%)、山西小麥品種(12.5%)、山東小麥品種(10.5%)、北京小麥品種(7.1%)。顯性等位基因Vrn-D1在北方冬麥區分布頻率呈現由黃淮冬麥區向北部冬麥區、由南向北逐漸減少的趨勢。顯性等位基因Vrn-B1只有在3個省份的小麥材料中檢測到，分布頻率為陜西最高(20.0%)，其次依次為河南(4.2%)、山東(3.5%)。所檢測小麥材料中甘肅和天津的品種各有1份，均不含顯性等位基因Vrn-B1和Vrn-D1。

表2 顯性等位基因Vrn-B1和Vrn-D1在不同省份小麥品種中的分布Tab.2 Distribution of dominant alleles Vrn-B1 and Vrn-D1 in wheat varieties of different provinces

該271份小麥材料共檢測到春化基因4種組合，分別為vrn-A1/Vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3、vrn-A1/vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3、vrn-A1/Vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3、vrn-A1/vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3。所檢測小麥材料中基因型為vrn-A1/vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3的品種有190份，其次依次是基因型為vrn-A1/vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3的品種(73份)、基因型為vrn-A1/Vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3的品種(6份)，基因型為vrn-A1/Vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3的品種只有2份。

2.3 北方冬麥區小麥春化基因組成與冬春性的相關性分析

2020年12月將這271份小麥材料播種于海南省三亞市，2021年1月調查田間抽穗情況。該生長周期，三亞市最低氣溫高于11℃(圖1)，因此，田間正常抽穗的品種為春性小麥。

圖1 三亞市氣溫變化Fig.1 Temperature change in Sanya City

進一步結合資料記載和表型調查結果，所檢測材料中偏冬性和半冬性品種最多，有184份，其次依次為冬性品種(53份)、弱春性品種(15份)、弱冬性品種(10份)，春性品種只有9份。

通過分析春化基因與小麥冬春性的關系，顯示在含有顯性春化基因Vrn-B1的8份品種中，半冬性品種3份、弱春性2份、春性3份，Vrn-B1基因型推測的表現型與冬春性的一致性為62.5%(表3)。含有顯性春化基因Vrn-D1的品種冬春性記載以半冬性為最多(53份)，其次為冬性(8份)、弱春性(7份)、春性(6份)、弱冬性(1份)，Vrn-D1基因型推測的表現型與冬春性的一致性僅為17.3%(表3)。供試小麥材料主效春化基因組成為全隱性(即基因型為vrn-A1/vrnB1/vrn-D1/vrn-B3)，冬春性記載中半冬性和偏冬性為最多(129份)，其次為冬性(45份)、弱冬性(9份)、弱春性(6份)，春性品種有1份，基因型推測的表現型與冬春性的一致性為96.3%。

以上結果表明，顯性等位基因Vrn-B1和Vrn-D1推測的表現型與冬春性的一致性較低，隱性等位基因組合vrn-A1/vrn-B1/vrnD1/vrn-B3推測的表現型與記載的冬春性一致性較高。產生這一現象的原因可能是顯性等位基因Vrn-B1和Vrn-D1對小麥的春化作用較弱，或在這些小麥材料中含有其他未檢測的春化基因。

表3 顯性等位基因Vrn-B1和Vrn-D1在不同冬春性品種中的分布Tab.3 Distribution of dominant Vrn-B1 and Vrn-D1 allele in different winterness-springness types

3 結論與討論

Yan等[6]通過利用單粒春小麥G2528和冬小麥G1777構建F2群體，發現VRN1與編碼MADS-box轉錄因子的基因AP1和AGLG1完全連鎖。進一步通過序列分析，發現AP1啟動子區的自然變異導致小麥的冬春特性不同[6]，并根據其啟動子區的序列差異開發出Vrn-A1基因在六倍體冬小麥和春小麥中的特異性檢測引物[20]。通過對春性小麥品種完整VRN1基因進行測序，發現其顯性等位基因VRN1在第一內含子區有4 kb的片段缺失，其中2.8 kb序列在隱性等位基因vrn1中具有高度保守性，并由此開發出春化基因VRN1的特異性檢測引物[21]。Yan等[9]研究發現，春性小麥品種在Vrn-B3的啟動子區存在一個逆轉錄轉座子插入，并根據該插入缺失設計出小麥冬春性特異性檢測引物。基于前人研究結果，本研究利用冬春性小麥VRN1和Vrn-B3啟動子區或內含子區插入缺失設計的特異性引物對271份北部冬麥區和黃淮冬麥區小麥主栽品種進行分子標記檢測，結果顯示，所檢測品種中均不含顯性等位基因Vrn-A1和Vrn-B3。

中國小麥地方品種中4個主效的春化基因分布頻率和分布地域差異較大。顯性等位基因Vrn-A1和Vrn-B1主要出現在東北和西北等春麥區；顯性等位基因Vrn-D1分布頻率呈現從南向北依次遞減趨勢；而顯性等位基因Vrn-B3在中國小麥品種中分布頻率極低[14，22]。姜瑩等[14]對中國小麥地方品種VRN1基因進行檢測發現，中國小麥地方品種中顯性春化基因Vrn-D1分布頻率較高，達60.8%；而顯性等位基因Vrn-B3在所檢測的品種中分布頻率為0。李哲等[22]對中國小麥主產區品種春化基因進行分子檢測，發現顯性等位基因Vrn-D1分布頻率高達44.6%，明顯高于顯性等位基因Vrn-B1(18.1%)和Vrn-A1(11.2%)，顯性等位基因Vrn-B3分布頻率僅為0.8%。郭總總等[23]對黃淮麥區91份小麥材料進行分子標記檢測，發現所檢測材料中不含顯性等位基因Vrn-A1和Vrn-B3，顯性等位基因Vrn-D1分布頻率為41.8%，明顯高于顯性等位基因Vrn-B1(6.6%)。游銀等[24]對黃淮麥區部分骨干親本的春化基因進行分析，發現所檢測材料中顯性春化基因Vrn-D1分布頻率為20.3%，顯性基因Vrn-B1分布頻率為4.7%，未檢測到顯性基因Vrn-A1和Vrn-B3的分布。本研究結果顯示，顯性等位基因Vrn-D1在271份供試小麥品種中分布頻率為27.7%，其次為Vrn-B1(3.0%)，Vrn-A1和Vrn-B3沒有分布，這可能是冬麥區小麥品種對春化作用的需求較強造成的。本研究結果與前人研究結果基本一致，說明顯性春化基因Vrn-D1和Vrn-B1是控制北部冬麥區和黃淮冬麥區小麥冬春性的主要基因。

據報道，冬麥區是小麥春化基因的基因型推測表現型與實際表現型一致性較差的區域，因此，進一步分析該麥區春化基因對小麥冬春性的影響尤為重要。姜瑩等[14]研究發現，我國春麥區春化基因推測的冬春性與實際小麥的冬春性一致性較高，冬麥區的一致性較低。趙彥坤等[25]對黃淮麥區北片小麥材料進行檢測發現，春化基因鑒定的基因型與表現型一致性較低，主要與Vrn-D1的顯性變異有關。本研究檢測了4個春化基因位點(Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和Vrn-B3)在小麥品種的分布，春化基因組合vrn-A1/vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3和vrn-A1/Vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3推測的表現型與冬春性的一致性較高，vrn-A1/vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3推測的表現型與冬春性一致性較低，其原因可能是由顯性春化基因Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1對低溫春化的敏感性和需求不同造成的[14]，顯性春化基因Vrn-B1對小麥春化發育特性的作用強于Vrn-D1、弱于Vrn-A1。由此可見，部分含有顯性等位基因Vrn-D1的材料需要春化才能開花結實，而包含顯性等位基因Vrn-B1的小麥材料對春化的需求明顯較弱。北部冬麥區和黃淮冬麥區小麥材料中可能存在其他控制春化作用的基因。