不同生育時期水稻土壤細菌群落特征與生態功能預測

陳秋圓，趙帥兵，梁 賀，劉 曄，崔燕妮，彭 廷，2，趙全志，2，張 靜，2

(1．河南農業大學 農學院，河南省水稻生物學重點實驗室，河南 鄭州 450046；2．河南農業大學，水稻河南省工程實驗室，河南 鄭州 450046)

水稻(Oryzasativa)是我國三大糧食作物之一，近些年，探究水稻產量形成的生理生態機制是農業工作者關注的焦點之一。水稻產量構成要素包括穗數、穗粒數、千粒質量和結實率[1]。氮素是水稻必需營養元素之一。在適宜的施氮量條件下，氮肥一般分3～5次施入大田，通常以基蘗肥和穗粒肥方式按一定比例施用。基蘗肥中氮肥除作為基肥外，分蘗肥通常在水稻插秧7 d后施入；穗粒肥則分別在孕穗期和抽穗期施入。分蘗期和拔節—孕穗期是水稻穗數和穗粒數形成的關鍵時期。合理施用分蘗肥可提高有效分蘗，控制無效分蘗。在穗軸分化期和花粉母細胞減數分裂期施用穗肥可促進枝梗和穎花分化、減少穎花退化，有利于千粒質量和結實率的提高。前人研究發現，土壤微生物在植物生長發育過程中的作用不容忽視。水稻內生細菌、土壤細菌群落與穗粒數呈顯著正相關關系；稻田土壤細菌的增加，可改善土壤細菌群落結構，增加水稻穗數和穗粒數[2-4]。因此，稻田土壤微生物中細菌與水稻產量及其構成要素形成關系密切，是實現水稻高產、穩產的重要生態因子之一[5]。

隨著高通量測序技術和生物信息學研究的發展，16S rRNA擴增子測序技術已成為研究環境微生物群落結構和組成的重要手段。國內外研究學者已有較多關于水稻[6-8]、小麥[9-11]、玉米[12]等作物土壤細菌群落結構方面的研究報道，發現稻田土壤優勢菌群主要為擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)等[13-16]。隨著施氮量增加，土壤細菌群落多樣性呈上升趨勢[17]。長期施肥條件下，土壤細菌多樣性及數量均較不施肥處理顯著增加[18]。已有報道指出，分蘗期稻田土壤微生物數量多、種類復雜、代謝能力強[19]。拔節—孕穗期是決定穗粒數多少的關鍵時期[20-21]。與分蘗期相比，孕穗期稻田土壤細菌群落結構存在顯著變化[22]。但不同生育時期水稻土壤細菌群落組成與結構、生態功能與產量間的關系報道較少。由于水稻高產栽培管理過程中，氮肥多以基蘗肥與穗粒肥按6∶4或7∶3的比例施入，因此，以2個高產水稻品種為材料，通過設置2個氮肥施用比例處理，采用 Illumina MiSeq 高通量測序技術，研究水稻分蘗期、拔節—孕穗期土壤細菌群落組成與結構、生態功能的差異，及其與土壤氮素、水稻產量的關系，旨在為深入解析土壤微生物在水稻產量形成中的作用機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 種植材料

2個水稻品種為Y兩優900和早豐優69。

1.2 試驗設計

試驗在河南農業大學信陽教學試驗基地(34°34′ N，115°33′ E)進行，設2種氮肥施用比例，基蘗肥和穗粒肥比例分別為6∶4(即基肥為40%，分蘗肥為20%，穗粒肥為40%)和7∶3(即基肥為40%，分蘗肥為30%，穗粒肥為30%)，總施氮量均為277.5 kg/hm2。小區面積60 m2，3次重復。基肥施750 kg/hm2復合肥(N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15)，分蘗肥以尿素形式施入。穗粒肥追施尿素分2次施入，倒四葉施入60%，剩余部分在倒二葉時施用。磷肥和鉀肥與氮肥的施用比例為N∶P2O5∶K2O=1∶0.5∶1，磷肥按1∶1的比例分別隨基肥和穗粒肥施入，鉀肥隨基肥一次性施入土壤。水稻于2015年4月30日播種，5月20日移栽，行株距為30 cm×21 cm，每穴2株。試驗期間其他田間栽培管理方式與當地保持一致。該地土壤pH值6.40，有機質含量29.30 g/kg，全氮含量1.00 g/kg，堿解氮36.75 mg/kg，速效磷16.50 mg/kg，速效鉀13.94 mg/kg。

1.3 水稻產量及其構成要素測定

成熟期選取長勢一致的2 m×2 m樣塊進行產量的測定，并調查各小區200穴記錄有效穗數，按照各小區有效穗數均值選取3株考種，測定穗粒數、結實率、千粒質量等。

1.4 土壤樣品采集

分別于水稻分蘗期和拔節—孕穗期取0～20 cm土壤樣品，液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱待測。

1.5 土壤生化性質測定

1.6 土壤微生物基因組DNA提取及文庫構建

土壤總DNA的提取采用Soil DNA Isolation Kit 試劑盒(Mo Bio，San Diego，CA)。以基因組DNA為模板，用簡并PCR引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，對16S rRNA基因的可變區V4進行聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)擴增，磁珠篩選目的片段，用合格文庫進行Cluster制備，設置30 bp窗口長度，通過Illumina平臺(Hiseq或Miseq)進行Paired-end測序[29-30]。

1.7 數據分析

16S rRNA擴增子數據主要運用QIIME 2進行分析[31]，測序數據經過濾、裁剪和拼接后形成Tags，用QIIME 2腳本中的DADA2進行質控，并生成代表性序列和特征表(ASV表)，之后用SILVA數據庫進行物種注釋。基于ASV表和物種注釋結果的分析及可視化通過R Studio(Version 4.1.0)軟件實現，包括采用QIIME 2和Vegan 2.5-7包分別進行Beta多樣性分析和冗余分析[32]，使用edgeR 3.36.0包進行差異分析 (Wilcoxon rank sum test)[33]，差異ASV篩選標準為FDR(False discovery rate)< 0.05，采用ggplot2 3.3.5包[34]作圖。土壤細菌群落結構的功能預測采用FAPROTAX(Functional annotation of prokaryotic taxa)方法[35]，并利用Pheatmap 1.0.12包繪圖[36]。使用SPSS 22.0 軟件進行Pearson相關系數計算及方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同生育時期稻田土壤氮素、細菌數量的差異分析

由表1可見，土壤氨氧化潛勢、硝化強度、硝態氮、銨態氮、全氮含量和細菌數量均在2個生育時期間存在顯著或極顯著差異。分蘗期7∶3處理中，Y兩優900土壤氨氧化潛勢和硝化強度均顯著低于早豐優69(P<0.05)。拔節—孕穗期早豐優69土壤銨態氮含量在2個氮肥處理中均顯著高于Y兩優900(P<0.05)，硝化強度則低于Y兩優900(P<0.05)；7∶3處理下，早豐優69土壤全氮含量顯著高于Y兩優900(P<0.05)。拔節—孕穗期，早豐優69土壤細菌數量7∶3處理比6∶4處理多35.31%。同時，土壤細菌數量還受到生育時期、氮肥及生育時期和品種交互作用的影響。

2.2 水稻產量及其構成要素與不同生育時期土壤生化因子的相關性分析

從產量及其構成要素來看(表2)，穗粒數、結實率和產量在2個品種間均存在顯著或極顯著差異，2個施氮比例對產量及其構成要素無顯著影響。Y兩優900的結實率在2個施氮處理下均顯著低于早豐優69(P<0.05)。早豐優69穗粒數在6∶4和7∶3處理中分別比Y兩優900顯著增加了32.52，63.29粒。早豐優69在7∶3處理的產量比Y兩優900提高10.63%。由相關性分析可知(表3)，產量與分蘗期土壤細菌數量呈顯著負相關關系(P<0.05)，而與拔節—孕穗期的細菌數量呈顯著正相關關系(P<0.05)，分蘗期細菌數量與有效穗數存在顯著正相關關系(P<0.05)，穗粒數與分蘗期和拔節—孕穗期的土壤氨氧化潛勢均呈顯著正相關關系(P<0.05)，分蘗期土壤全氮含量與穗粒數呈顯著負相關(P<0.05)，拔節—孕穗期土壤全氮含量與產量存在顯著正相關關系(P<0.05)。由此可見，水稻產量、有效穗數和穗粒數受到土壤細菌、氨氧化潛勢和全氮的調控。

表1 不同處理土壤生化因子含量變化Tab.1 Changes in the content of soil biochemical factors in different treatments

表2 不同處理水稻產量及其構成要素Tab.2 Rice yield and yield components in different treatments

2.3 不同生育時期稻田土壤細菌群落結構的差異分析

高通量測序結果顯示，24個土壤樣品共得到844 532條有效序列，通過QIIME 2將優化序列在100%相似度下進行聚類，獲得5 868個ASV。以Bray-Curtis距離做非限制性主坐標分析(Principal coordinate analysis，PCoA)結果顯示 (圖1)，稻田土壤細菌群落在第一主坐標軸(PCo1)上按時期被分成2簇，其貢獻率為17.05%，品種是第2主坐標軸(PCo2)上樣品差異的主要因素，PCo2的貢獻率為10.09%，表明不同生育時期會導致稻田土壤細菌群落結構變化，同時，稻田土壤細菌群落結構還受到品種的影響。

2.4 不同生育時期稻田土壤細菌群落組成的差異分析

分蘗期和拔節—孕穗期Y兩優900和早豐優69的稻田土壤優勢菌群組成在不同分類水平存在差異(圖2)。在門和綱水平上，分蘗期的綠彎菌門(Chloroflexi)相對豐度比拔節—孕穗期高6.16 百分點，其中Y兩優900高出9.35百分點，早豐優69高出2.97百分點；拔節—孕穗期的變形菌門相對豐度比分蘗期高0.69百分點，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)相對豐度比分蘗期高1.66百分點，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)相對豐度比分蘗期低0.27百分點；拔節—孕穗期的擬桿菌門相對豐度比分蘗期高1.09百分點，早豐優69土壤中擬桿菌門相對豐度比Y兩優900高2.88百分點；分蘗期的酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度比拔節—孕穗期高出2.65百分點。

表3 土壤生化因子與產量及其構成要素的相關性分析(n=12)Tab.3 Correlation analysis between soil biochemistry indexes and yield，its components

分蘗期和拔節—孕穗期Y兩優900和早豐優69土壤中富集的ASV存在重疊，Y兩優900在2個生育時期土壤中共同富集25個ASV，占分蘗期富集的56.81%，占拔節—孕穗期富集的43.86%(圖3-A)，主要屬于綠彎菌門、變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門(圖3-B)。早豐優69土壤中有8個ASV在2個生育時期中共同富集，占分蘗期的32.00%， 拔節—孕穗期的42.10%(圖3-C)，主要屬于厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和綠彎菌門 (圖3-D)。分蘗期和拔節—孕穗期富集的ASV在Y兩優900和早豐優69土壤中也存在重疊，拔節—孕穗期有15個ASV在2個品種中共同富集，占Y兩優900的88.23%，早豐優69的71.43%(圖3-E)，這15個 ASV主要屬于變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門(圖3-F)；分蘗期有24個ASV在2個品種中共同富集，占Y兩優900的77.42%，早豐優69的64.86%(圖3-G)，這24個ASV主要屬于綠彎菌門、變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門(圖3-H)。總的來說，ASV水平上2個生育時期間差異富集的細菌在門水平包括綠彎菌門、變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門；2個品種間差異富集的細菌在門水平主要為綠彎菌門、變形菌門、酸桿菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。

Y.Y兩優900；Z.早豐優69；T.分蘗期；J.拔節—孕穗期。圖2—5同。Y.Y Liangyou 900；Z.Zaofengyou 69；T.Tillering stage；J.Jointing—booting stage.The same asFig.2—5.

Y-6∶4.氮肥比例6∶4處理的Y兩優900；Z-6∶4.氮肥比例6∶4處理的早豐優69；Y-7∶3.氮肥比例7∶3處理的Y兩優900；Z-7∶3.氮肥比例7∶3處理的早豐優69。其他指相對豐度排名前10以外的其他細菌。因變形菌門豐度較高，相對豐度為綱水平，其余為門水平。

A.2個時期Y兩優900土壤富集的ASV；B.2個時期Y兩優900土壤富集ASV的組成；C.2個時期早豐優69土壤富集的ASV；D.2個時期早豐優69土壤富集ASV的組成；E.拔節—孕穗期土壤富集的ASV；F.拔節—孕穗期土壤富集ASV的組成。G.分蘗期土壤富集的ASV；H.分蘗期土壤富集ASV的組成。

2.5 不同生育時期稻田土壤優勢細菌與環境因子的RDA分析

將稻田土壤理化性質與相對豐度前十的細菌門(綱)進行冗余分析(RDA)發現，2個生育時期(圖4-A、B)和2個品種(圖4-C、D)的稻田土壤優勢細菌群落組成存在差異，且受到土壤理化因子的影響。由圖4-A可知，RDA1對因變量矩陣貢獻率為55.00%，RDA2對因變量貢獻率為18.88%，其中銨態氮對分蘗期稻田土壤微生物群落影響極顯著 (P<0.01，表4)。由圖4-B可知，2個坐標軸分別解釋了52.42%和23.70%的拔節—孕穗期稻田土壤微生物群落變化，其中氨氧化潛勢對拔節—孕穗期稻田土壤微生物群落的影響達到顯著水平(P<0.05，表4)。

A.分蘗期環境因子與稻田土壤細菌群落結構的RDA分析；B.拔節—孕穗期環境因子與稻田土壤細菌群落結構的RDA分析；C.Y兩優900品種環境因子與稻田土壤細菌群落結構的RDA分析；D.早豐優69品種環境因子與稻田土壤細菌群落結構的RDA分析。

2.6 不同生育時期稻田土壤細菌生態功能預測

利用 FAPROTAX對高通量測序所得的5 868個ASV進行生態功能預測發現(圖5)，不同生育時期稻田土壤細菌生態功能在品種和氮肥處理間具有較大差異。與氮循環功能有關的一氧化二氮反硝化作用、亞硝酸鹽反硝化作用、硝酸鹽反硝化作用和反硝化作用等功能均表現出分蘗期7∶3處理下豐度較高，尤以Y兩優900稻田土壤中相對豐度最高。說明施氮比例和品種的不同引起了土壤氮素反硝化作用的變化，分蘗期7∶3氮肥處理下土壤細菌的反硝化功能增強。

圖5 不同處理間稻田土壤細菌功能相對豐度差異熱圖Fig.5 Heat map of differences in relative abundances of soil bacterial functions in paddy soils among different treatments

3 結論與討論

綜上所述，施氮比例7∶3和6∶4處理下，水稻分蘗期土壤細菌數量增加可促進有效穗數的形成，拔節—孕穗期土壤細菌數量的增加有利于水稻產量的形成。土壤細菌群落構成及生態功能在分蘗期和拔節—孕穗期2個生育時期間存在明顯差異。拔節—孕穗期較高的土壤氨氧化潛勢，有利于水稻穗粒數的增加。分蘗期7∶3處理的土壤氨氧化潛勢高于6∶4處理，且土壤細菌的反硝化功能較強，產量較低的Y兩優900土壤細菌的反硝化功能高于產量較高的早豐優69。因此，稻田土壤細菌數量、細菌群落構成與生態功能的差異可影響水稻有效穗數、每穗粒數和產量的形成。