獼猴桃AcWRKY70基因序列克隆及其對潰瘍病病原菌和激素處理表達模式分析

曲 東，燕 飛，3，劉欣瑞，康 雪，曾海濤，3，張 羽，3，4

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001；3.陜南秦巴山區生物資源綜合開發協同創新中心，陜西 漢中 723001；4.秦巴生物資源與生態環境省部共建國家重點實驗室，陜西 漢中 723000)

獼猴桃為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLind L.)木質藤本果樹，原產于我國，因其果實維生素C含量高并富含豐富的營養物質而深受人們喜愛[1]。然而，隨著獼猴桃栽培面積迅速擴大，獼猴桃潰瘍病、根腐病等病害已經嚴重影響了獼猴桃產業的發展，尤其是丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)引起的獼猴桃潰瘍病的發生，對獼猴桃樹生長發育的危害往往是毀滅性的，嚴重時會使得植株死亡造成毀園，給果農帶來難以負擔的經濟損失[2]。目前，獼猴桃潰瘍病抗病分子機理研究報道較少，因此，挖掘獼猴桃抗潰瘍病關鍵基因、探究其響應病原菌脅迫應答機制正逐漸成為當前獼猴桃育種研究的熱點問題。

轉錄因子(Transcription factors，TFs)是植物信號傳導途徑的重要組成部分，它決定了植物對生物和非生物脅迫刺激的反應能力，及其對植物發育過程中植物內部信號的響應[3]。WRKY轉錄因子是植物中特有的一類轉錄調節因子，也是轉錄因子中最大的家族[4]。在生物及非生物脅迫響應中，WRKY轉錄因子在多個信號轉導途徑的調控中起關鍵作用[5]。近年來，多種植物WRKY超家族成員已被報道，包括大豆(197個)、擬南芥(75個)、大麥(45個)、西瓜(63個)等[6-8]。WRKY轉錄因子DNA結合域(DNA-binding domain，DBD)以N-端的保守的WRKYGQK氨基酸序列和C-端的鋅指結構域為特征[4]，依據N-端DBD的數量和C-端鋅指結構序列特征可將WRKY轉錄因子分為四類組：Ⅰ組(2個WRKY DBD)、Ⅱ組(一個DBD和不同的C2-H2鋅指結構)、Ⅲ組(1個DBD和C2-HC鋅指結構)和Ⅳ(不完整WRKY結構域，不含鋅指結構)[9]。研究表明，WRKY轉錄因子能夠與(T)TGAC(C/T)結合(如W-box)，從而誘導相關基因表達維持細胞內穩態；其以多種同源和異二聚體組合作為激活劑或阻遏劑參與各種細胞質和核過程[4，10]。

許多物種的WRKY家族都被證實可直接或間接參與植物的生長、發育、生物和生理過程，而且在植物非生物脅迫反應與植物天然免疫過程中起重要作用[4，11-12]。研究表明，TaWRKY33基因在小麥耐鹽脅迫響應中發揮重要作用[13]。將擬南芥的WRKYIIa亞家族成員在水稻中過表達，能夠提高水稻抵抗白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv．ryzae)的抗病性[14]；分析沉默BnWRKY70基因的油菜植株，在接種黑脛病菌(Leptosphaeriabiglobosa)之后，發現基因沉默油菜葉片更易感病，表明油菜BnWRKY70基因沉默使得油菜易感黑脛病[15]；在抗白粉病(ErysiphegraminisD.c.f.sp.triticiE.Marchal)小麥(Brock)品種中發現TaWRKY26基因在小麥對白粉菌侵染的應答反應過程中發揮了積極作用[16]。另外研究發現，WRKY轉錄因子的表達能夠被植物激素調控，如脫落酸(Abscisic acid，ABA)誘導OsWRKY51和OsWRKY71基因抑制水稻種子糊粉層細胞中的赤霉素(GA)信號[17]。同樣，AtWRKY18、AtWRKY40、AtWRKY60轉錄因子參與由植物激素水楊酸(Salicylic acid ，SA)和茉莉酸(Jasmonic acid，JA)介導的信號通路[18]。當沉默辣椒CaWRKY40基因后，辣椒抗青枯假單胞桿菌(Ralstoniasolanacearum)抗性下降，而外源SA、JA能夠上調該基因的表達[19]。棉花GhWRKY22基因沉默植株對棉花黃萎病病原菌大麗輪枝菌的敏感性增加，該基因是通過SA和JA激素的途徑參與病原菌響應過程的[20]。

研究人員在提高植物抗病能力方面進行了大量的研究，但目前在獼猴桃抗潰瘍病脅迫響應方面的相關報道較少。為挖掘獼猴桃關鍵抗病基因，探究AcWRKY70基因在獼猴桃抗病響應中的作用，本研究以抗病品種徐香和高感病品種紅陽獼猴桃為材料[21]，克隆AcWRKY70基因序列，并進行蛋白性質及結構分析、系統進化等生物信息學分析；采用熒光定量PCR(qRT-PCR)方法探究該基因在不同抗性獼猴桃品種根、莖、葉、花組織中的表達模式及不同抗性獼猴桃品種在病原菌(Psa)、水楊酸與Psa(SA+Psa)共同處理和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)與Psa(MeJA+Psa)共同處理下的表達差異，初步探究AcWRKY70轉錄因子在不同抗性品種獼猴桃響應潰瘍病脅迫作用機制，以期為AcWRKY70轉錄因子在獼猴桃抗潰瘍病相關研究和應用提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理

試驗材料源自陜西省漢中市城固縣自然好獼猴桃專業合作社獼猴桃園，移栽于陜西省資源生物重點實驗室的嫁接2年生高感病品種紅陽獼猴桃(Actinidiachinensisvar.chinensisHongyang)和抗病品種徐香(Actinidiadeliciosavar.Xuxiang)獼猴桃幼苗。

分別取紅陽獼猴桃和徐香獼猴桃的莖、花、葉，裝入無菌的樣品管內標記，放入液氮速凍，并保存于-80 ℃冰箱備用。

將紅陽獼猴桃和徐香獼猴桃幼苗分為4組，噴灑水為第1組(正常生長組)，先用水對葉片進行噴灑，7 d后用丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種菌液(陜西省資源生物實驗室分離鑒定保存菌種，GenBank序列登錄號：MW404385，菌液濃度1.0×108cfu/mL)進行噴灑處理為第2組(Psa)；先用水楊酸(2.5 mmol/L)對葉片進行噴灑預處理，7 d后用丁香假單胞獼猴桃致病變種液噴灑葉片為第3組(SA+Psa)；先用茉莉酸甲酯(1 mmol/L)對葉片進行噴灑預處理，7 d后用丁香假單胞獼猴桃致病變種液噴灑葉片為第4組(MeJA+Psa)，預處理方法參照文獻[22]；處理后分別在0，6，12，24，48，72 h 這5個時間點取樣，裝入無菌的樣品管內，用記號筆標記采取樣品的處理和時間，立即放入液氮，轉入-80 ℃冰箱保存待用，每個樣品重復3 次。

1.2 獼猴桃AcWRKY70基因的克隆及測序

采用TransZol Plant試劑(TransGen Biotech)提取不同處理時期樣品RNA，經電泳檢測(1%瓊脂糖凝膠)合格，Thermo NanoDrop 2000分光光度計測定各樣品的濃度以及OD260/280、OD260/230值；后反轉錄為cDNA(TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix，TransGen Biotech)并保存于-20 ℃冰箱備用。

根據本實驗室前期WRKY轉錄因子預測分析，以獼猴桃數據庫(http：//kiwifruitgenome.org/)中WRKY蛋白基因的序列(Ach24g147941-TA)為模板，利用Primer 6.0軟件設計引物，AcWRKY70基因上下游引物分別為5′-ATGGGCATCCTTCGGC-3′和5′-TCACTCACCCTCACCAA-3′。以獼猴桃葉片cDNA為模板，利用高保真酶進行PCR，退火溫度為54 ℃，PCR產物檢測(1%瓊脂糖凝膠)、膠回收(E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit)、載體連接等方法參照本實驗室方法[23]，選取陽性克隆送北京擎科生物有限公司(西安測序部)進行測序。

1.3 AcWRKY70序列的生物信息學分析

利用ORF finder(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線分析開放閱讀框，通過 NCBI Conserved Domain Search Service在線分析AcWRKY70蛋白序列的保守結構域(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)；利用DNAMAN 9.0 軟件對獼猴桃AcWRKY70蛋白質與其他物種WRKY蛋白質進行比對分析；使用 ClutsalX v1.83 程序進行多序列比對，然后將比對結果輸入到Mega 7.0 軟件中，利用鄰接法 (Neighbor-joining，NJ)構建系統發育樹，Bootstrap 值取 1 000 次；利用 ExPASy-ProtParam tool 在線軟件(http：//web.expasy.org/protparam/)進行蛋白質理化性質分析；利用 Expasy 中的 ProtScale 在線軟件(http：//web.expasy.org/protscale/)分析AcWRKY70蛋白質的親水性和疏水性；利用NetPhos v3.1(http：// www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線工具對獼猴桃 AcNPR1蛋白進行潛在的磷酸化位點預測分析；利用SOPMA數據庫(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)得到AcWRKY70可能的二級結構；利用 SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org)進行同源建模，構建AcWRKY70的三級結構域模型；通過CELLO2GO 在線分析工具(http：//cello.life.nctu.edu.tw/cello2go/)預測亞細胞的可能定位。

1.4 AcWRKY70基因實時熒光定量分析

熒光定量反應程序及反應體系按照熒光定量試劑盒(Perfectstart Green qPCR Supermix，全式金生物，北京)說明完成，采用美國ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀系統進行實時熒光定量分析。熒光定量上下游引物分別為5′-GCTACGGAATCTATTGGAGA-3′和5′-AATCACACGCACACTTCA-3′；內參基因上下游引物分別為5′-CTGTGAAACTGCGAATGGCTC-3′和5′-TTCCAGAAGTCGGGGTTTGT-3′，試驗采用3次生物學重復，不同材料中目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算。利用 SPSS 21.0統計分析軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 AcWRKY70基因克隆以及序列分析

據本實驗室前期對獼猴桃WRKY轉錄因子家族生物信息學分析，預測得到一個與AtWRKY70最密切相關的獼猴桃WRKY基因，將該序列(Ach24g147941-TA)命名為AcWRKY70，為AcWRKY70基因序列設計特異性引物，并以紅陽葉片RNA反轉錄產物為模板進行AcWRKY70基因序列PCR擴增(圖1-A)，測序得AcWRKY70基因序列全長為906 bp(GenBank登錄號：MW881147)。另外，以徐香葉片cDNA為模板獲得的WRKY基因序列與紅陽AcWRKY70基因序列只有個別堿基有差異。對紅陽AcWRKY70基因序列進行生物信息學分析， NCBI ORF Finder 在線工具進行開放閱讀框預測結果顯示，AcWRKY70基因含有開放閱讀框長度為885 bp，編碼294個氨基酸；NCBI Conserved domains在線工具分析表明，該蛋白結構中第122—182位區域間含有1個WRKY保守結構域，包含61個氨基酸(圖1-B)。

2.2 AcWRKY70基因編碼的氨基酸序列比對分析

將克隆得到的獼猴桃AcWRKY70基因的氨基酸序列在NCBI數據庫中進行序列比對，利用DNAMAN 9.0對不同物種WRKY轉錄因子的氨基酸序列多重比較，結果表明，獼猴桃AcWRKY70氨基酸序列與中華獼猴桃(Actinidiachinensis)、茶樹(Camelliasinensis)、藍果樹(Nyssasinensis)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)、楊梅(Morellarubra)、銀白楊(Populusalba)、葡萄(Vitisvinifera)的WRKY類轉錄因子保守結構域一致性較高，N端有一個WRKYGQK保守結構域，C端為CX7CX24HXC(C2-HC)型鋅指結構，屬于Ⅲ類 WRKY 轉錄因子(圖2)；其與中華獼猴桃、茶樹、藍果樹蛋白序列相似性分別為99.32%，50.62%，48.73%。

M.GL DNA Marker 2000 Ladder；1.紅陽AcWRKY70基因PCR 擴增產物。M.GL DNA Marker 2000 Ladder；1.PCR product of Hongyang AcWRKY70 gene.

紅色框線.WRKYGQK保守結構域；紅色箭頭.C2-HC鋅指結構域。Red box.The conserved domain of WRKYGQK;Red arrows.The zinc finger domain of C2-HC.

2.3 獼猴桃AcWRKY70的系統進化分析

采用 Mega 7.0 軟件對12個物種的WRKY蛋白序列與紅陽獼猴桃AcWRKY70蛋白序列進行系統進化分析并構建進化樹(圖3)，結果顯示，WRKY蛋白被大致分為2組，紅陽獼猴桃AcWRKY70蛋白與楊梅、銀白楊、葡萄、茶樹等聚為一組，紅陽獼猴桃AcWRKY70蛋白與茶樹和藍果樹WRKY蛋白親緣關系最近。

紅陽獼猴桃AcWRKY70蛋白序列位于紅框中。The AcWRKY70 protein sequence of kiwifruit is located in the red frame.

2.4 AcWRKY70基因編碼蛋白的理化性質及磷酸化位點分析

利用在線工具ProtParam 分析AcWRKY70基因編碼的蛋白質的分子式為 C1436H2271N405O455S23，編碼 295個氨基酸，分子質量為 33.226 ku，理論等電點(pI)5.94，脂肪指數為 58.01，不穩定指數Ⅱ為58.52，屬于不穩定蛋白；通過對氨基酸疏水性進行分析，總平均親水性系數為-0.545，為親水性蛋白。利用 NetPhos 對該蛋白的磷酸化位點進行分析，發現AcWRKY70蛋白均具有絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Try)磷酸化位點(圖4)。

圖4 AcWRKY70 蛋白磷酸化位點預測Fig.4 The phosphorylation sites prediction of AcWRKY70 protein

2.5 AcWRKY70蛋白二、三級結構分析及亞細胞定位分析

利用SOPMA在線預測軟件對AcWRKY70基因編碼蛋白的二級結構進行分析，發現AcWRKY70蛋白的二級結構由無規則卷曲、α-螺旋、延伸鏈、β-轉角四部分構成，占比分別為64.75%，23.05%，9.49%，2.71%；無規則卷曲是AcWRKY70蛋白的主要二級結構。通過SWISS-MODEL軟件對AcWRKY70蛋白的三級空間結構模型進行預測，結果表明，該蛋白至少由3個α-螺旋、2個較穩定的反向平行β-折疊和許多無規則卷曲構成 (圖5)。利用CELLO2GO在線工具進行亞細胞定位預測，結果顯示，AcWRKY70蛋白亞細胞定位在細胞核得分為2.85，遠遠高于細胞中其他部位，AcWRKY70蛋白最可能定位于細胞核當中參與獼猴桃其他基因表達的調控過程。

圖5 AcWRKY70蛋白三級結構預測Fig.5 The tertiary structure prediction of AcWRKY70 protein

2.6 獼猴桃AcWRKY70基因在不同處理條件下的表達模式分析

2.6.1AcWRKY70基因組織表達模式分析 通過qRT-PCR技術分別對紅陽和徐香2個品種中AcWRKY70基因在根、莖、葉、花不同組織中相對表達量進行分析，結果表明，AcWRKY70基因在徐香和紅陽(圖6)2個品種中基因相對表達量由高到低均為葉>莖>花，葉片中AcWRKY70基因相對表達量最高，顯著高于莖、花中的基因表達量(P<0.05)。

不同小寫字母代表不同處理存在顯著差異(P<0.05)。圖7同。Different lowercase indicate significant difference in different treatments， P<0.05．The same asFig.7.

2.6.2AcWRKY70基因在病原菌處理、病原菌與水楊酸預處理、病原菌與茉莉酸甲酯預處理下的表達模式分析 實時熒光定量分析Psa、SA+Psa以及MeJA+Psa處理下不同抗性品種獼猴桃AcWRKY70基因表達水平的變化情況，結果表明，在Psa處理下的，0 h高感病品種紅陽獼猴桃中AcWRKY70基因相對表達量迅速上升至正常生長葉片的3.18倍，抗病品種徐香獼猴桃中AcWRKY70基因相對表達量上升至正常生長葉片的1.85倍；6 h后2個品種中AcWRKY70基因相對表達量均呈現先升高后下降的趨勢(圖7-A)，特別是抗病品種徐香獼猴桃在12 h基因相對表達量急劇升高至峰值，為正常生長葉片的80.58倍，在24，48 h基因相對表達量雖呈降低趨勢，但仍處于較高水平，分別為正常生長葉片的13.68，8.65倍；而高感病紅陽品種中AcWRKY70基因相對表達量始終維持在較低水平，除了在48 h基因相對表達量為正常生長葉片的3.03倍，Psa處理下高感病品種紅陽AcWRKY70基因相對表達量始終低于抗病品種徐香(除0 h之外)(圖7-A)。

在SA+Psa處理下，0 h高感病品種紅陽中AcWRKY70基因相對表達量為正常生長葉片的1.95倍，抗病品種徐香中AcWRKY70基因相對表達量迅速升高至正常生長葉片的4.01倍；之后徐香AcWRKY70基因相對表達量均呈現先升高后下降的趨勢，在12 h基因相對表達量達到最大，為正常生長葉片的39.91倍，紅陽AcWRKY70基因相對表達量在6～72 h內波動變化，72 h達到最大，為正常生長葉片的2.95倍，且該處理下0，6，12，24 h紅陽基因相對表達水平低于徐香(圖7-B)。

在MeJA+Psa處理下，6 h高感病品種紅陽中AcWRKY70基因相對表達量為正常生長葉片的1.09倍，抗病品種徐香中AcWRKY70基因相對表達量迅速升高至正常生長葉片的5.42倍；之后徐香AcWRKY70基因相對表達量呈現先升高后下降的趨勢，12 h基因相對表達量達到最大，為正常生長葉片的42.22倍，紅陽AcWRKY70基因相對表達量在6～72 h內波動變化，24 h達到最大，為正常生長葉片的2.66倍(圖7-C)。

3 結論與討論

近年來，WRKY轉錄因子由于其參與植物生長發育多個過程、生物和非生物脅迫反應及植物天然免疫過程(包括微生物或病原體相關分子模式觸發免疫反應(MTI或 PTI)和誘發免疫反應(ETI))而被廣泛關注[4，11-12]，然而，關于獼猴桃WRKY轉錄因子在潰瘍病脅迫反應中的響應機制報道較少。

脅迫反應相關基因的誘導表達主要發生在轉錄水平，植物特異性轉錄因子家族就是大量參與植物脅迫響應誘導特定應激相關基因表達的重要部分[24]。大量研究表明，WRKY轉錄因子家族參與了受體介導的過程從而誘導脅迫響應相關基因表達[4]。研究表明，在已報道的72個擬南芥WRKY基因中，有49個WRKY基因能夠被獼猴桃潰瘍病致病菌不同程度調控表達[25]。本研究表明，獼猴桃潰瘍病致病菌侵染獼猴桃后，在抗病品種徐香中Psa誘導AcWRKY70基因迅速表達；而在高感病品種紅陽中只在0，48 hAcWRKY70基因表達量被上調，可見，AcWRKY70基因在響應獼猴桃潰瘍病脅迫反應中發揮了作用。值得注意的是，在抗病品種徐香中AcWRKY70基因強烈響應Psa脅迫，表達量急劇升高，遠高于感病品種中基因表達量，這可能與不同品種間抗病性、抗病機制存在差異有關，AcWRKY70基因可能通過誘導抗病相關基因的表達從而提高徐香獼猴桃的抗病性。這與煙草抗病與感病品種中WRKY2、WRKY11基因的表達情況類似，當煙草受黃瓜花葉病毒侵染后，煙草抗病品種臺煙8號中WRKY轉錄因子表達量增加，而感病品種K326中WRKY轉錄因子未受明顯誘導[26]。除此之外，AcWRKY70基因在抗病品種中可能主要參與了植物對病原菌的早期抗性反應，這與煙草中WRKY轉錄因子表達情況也一致。

脅迫響應往往與激素信號相關，WRKY轉錄因子也是復雜的植物激素信號網絡中的一個重要部分。研究表明，擬南芥中屬于WRKY轉錄因子第Ⅲ類的WRKY70和WRKY46基因能夠被SA和病原體誘導大量表達從而提高植物抗病性[27]。本研究中，經過Psa處理后抗病品種徐香與高感病品種紅陽AcWRKY70基因均被上調表達，這與AcWRKY屬于WRKY轉錄因子第Ⅲ類家族特征一致[28]；SA+Psa處理0 h抗病品種徐香AcWRKY70基因相對表達水平高于高感病品種紅陽中該基因相對表達水平，表明AcWRKY70基因表達水平受到SA處理的影響，且不同抗性品種間該基因調控機制方面存在差異。研究表明，經過SA預處理的海沃德獼猴桃葉片接種Psa后， Psa定殖率僅為只接種Psa獼猴桃葉片的46%[22]。在MeJA+Psa處理0 h，抗病品種徐香AcWRKY70基因相對表達水平也高于高感病品種紅陽中該基因相對表達水平，表明茉莉酸甲酯預處理對于AcWRKY70基因的表達具有調控作用，基因表達水平的變化可能與SA預處理、MeJA預處理降低了Psa在獼猴桃葉片上的定殖率有關；這與辣椒CaWRKY27轉錄因子響應SA、JA信號提高抗病性一致[29]；在高感病品種紅陽中AcWRKY70基因相對表達量始終處于較低水平，這可能與AcWRKY70轉錄因子在不同抗病性品種間調控機制不同有關，其可能是導致獼猴桃高感病品種紅陽和抗病品種徐香抗性差異的原因之一。

本研究克隆并分析不同抗性獼猴桃品種中AcWRKY70基因在Psa、SA+Psa、MeJA+Psa處理條件下的基因表達情況，結果表明，AcWRKY70基因受Psa誘導表達且在不同抗病性獼猴桃品種間的作用機制存在差異，SA、MeJA預處理可以提高抗病獼猴桃品種的抗病能力，但具體機制仍需繼續探究，今后將進一步探索AcWRKY70轉錄因子在抵御獼猴桃潰瘍病中的調控機制，為AcWRKY70基因的抗病功能的研究和應用奠定基礎。