溪黃草多酚提取工藝研究

＊宋照風 譚杰安 周子凡 朱峰 趙海全

（佛山科學技術學院 廣東 528000）

溪黃草又稱風血草、土黃連等，莖葉有細條紋，屬唇形科的全草植物[1]。溪黃草常成叢生長在河邊、溪邊、草地等光照充足的地方，在我國的很多地區都能生長。溪黃草具有涼血退瘀、清熱祛濕及退黃等藥用價值[2]。目前，對于溪黃草的臨床應用，直接水煎服用或提取有效活性成分制成復方中成藥治療疾病[3]。溪黃草含有多糖、多酚、氨基酸、萜類化合物等有機活性物質[4]。多酚作為一種重要的次生代謝產物存在于溪黃草的莖葉中[5]。多酚普遍存在于植物中，它不僅是天然的抗氧化劑，還是重要的功能因子[6]。近年來，關于溪黃草多酚提取工藝[7]的研究報道比較少，為了能夠有效提取利用溪黃草中的多酚。超聲輔助提取溪黃草多酚相對而言成本較低、易于操作、提取效率高、實用性強。目前多酚檢測的方法是福林酚法。本文圍繞提取的料液比、溶劑的體積分數、提取溫度、超聲輔助時間設計正交試驗，對溪黃草多酚的提取工藝進行優化。

1.材料與方法

(1)主要原料和儀器

溪黃草購于當地，焦性沒食子酸、福林酚等為分析純。分光光度計為上海美譜達UV-1100等。

(2)溪黃草多酚的提取

將溪黃草粉碎，過60目篩備用；取1.00g溪黃草于燒杯中，按料液比為1:30，加入70%的乙醇；將混合液置于40℃恒溫水浴中10min；在超聲機中提取30min；過濾，濾液在4000r/min離心10min。取上清液加水至100mL，以測定多酚的提取率；按上述步驟，進行單因素試驗及正交試驗；根據福林酚法繪制標準曲線，計算多酚的產量及提取率。

(3)福林酚法測定多酚含量

①標準溶液的配制

準確稱取0.050g焦性沒食子酸，加水定容至50mL，得到焦性沒食子酸質量濃度為1mg·mL-1。從上述焦性沒食子酸溶液中準確量取0.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL溶液，分別加入到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容，即配置得到質量濃度分別為0.000mg·mL-1、0.020mg·mL-1、0.040mg·mL-1、0.060mg·mL-1、0.080mg·mL-1、0.100 mg·mL-1的沒食子酸標準溶液。

②標準曲線測定方法

根據福林酚法，取1.00mL不同濃度標準溶液于試管中，加入1.5mL福林酚溶液，再加入10mL水，避光靜置5min，加入6mL碳酸鈉緩沖溶液，避光反應1h。測定其吸光度值A，以標準溶液的濃度（mg·mL-1）對吸光度值繪制出標準曲線。

根據實驗數據，得到焦性沒食子酸標準曲線方程為y=7.9414x+0.0494。該方程的相關系數為R2=0.9988線性回歸方程的擬合較好。

(4)數據處理與統計

正交設計試驗采用正交軟件進行設計和實驗數據的處理。

2.結果與分析

(1)乙醇體積分數的影響

取溪黃草1.00g，乙醇料液比為1:30，加入等量的體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇。將混合液放到40℃恒溫水浴中，提取10min后，再轉移到40℃超聲中，提取30min。取出混合液過濾。濾液高速離心10min，收集上清液，并加水至100mL得到溪黃草多酚待測液。用福林酚法測定不同濃度乙醇對溪黃草多酚提取影響曲線圖。

由圖1可知，隨著乙醇體積分數的增大，溪黃草多酚的提取率升高，當乙醇體積分數達到70%，溪黃草多酚的提取率最大。隨著乙醇體積分數繼續增加，溪黃草多酚的提取率反而下降，其總體呈現出先增后減的趨勢。

圖1 乙醇體積分數的影響試驗結果分析圖

(2)料液比的影響

取溪黃草1.00g，加入乙醇料液比為1:20、1:30、1:40、1:50、1:60，加入體積分數為70%的乙醇。將混合液放到40℃恒溫水浴提取10min，再把混合液轉移到40℃超聲中提取30min。過濾，濾液高速離心10min，收集上清液，并加水至100mL得到溪黃草多酚待測液。用福林酚法測定出不同料液比對溪黃草多酚提取結果的影響曲線圖。

從圖2可知，隨著料液比的減小，溪黃草多酚的提取率升高，在料液比為1:50時，溪黃草多酚的提取率出現最大，而隨著料液比的進一步減小，溪黃草多酚的提取率反而開始逐漸下降。因為料液比越小，加入的溶劑越多，不利于溪黃草多酚的提取。

圖2 料液比的影響試驗結果分析圖

(3)超聲提取時間的影響

取溪黃草1.00g，乙醇溶劑料液比1:50，加入等量的體積分數為70%的乙醇。將混合液放到40℃水浴鍋中提取10min，混合液轉移到超聲中，提取10min、20min、30min、40min、50min，提取溫度為40℃。過濾，濾液高速離心10min，上清液加水至100mL得到溪黃草多酚待測液。用福林酚法測定出不同超聲提取時間對溪黃草多酚提取結果的影響曲線圖。從圖3可知，隨著超聲提取時間的增大，溪黃草多酚的提取率升高，而且在超聲提取時間為30min時，溪黃草多酚的提取率出現最大，而后隨著超聲輔助提取時間進一步增大，溪黃草多酚的提取率反而逐漸下降。由于超聲具有空化效應和機械效應，可能會使溶劑中的多酚發生分解，導致產率降低。

圖3 超聲提取時間的影響試驗結果分析圖

(4)提取溫度的影響

取溪黃草1.00g，加入乙醇料液比為1:50，加入等量的體積分數均為70%的乙醇溶劑。將溪黃草與乙醇的混合液放到水浴中，水浴溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，水浴提取10min后，把溶液轉移到超聲中，輔助提取30min，超聲輔助溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃。取出溪黃草多酚提取液過濾。濾液高速離心10min，收集上清液，并加水至100mL得到溪黃草多酚樣品待測液。用福林酚法測定出不同提取溫度對溪黃草多酚提取結果的影響曲線圖。

從圖4中的曲線可以看出，溫度越高，溪黃草多酚越不穩定，當超過一定溫度時，溪黃草多酚會發生分解使得提取率降低，所以總體呈現出先增后減的趨勢。

圖4 提取溫度的影響結果分析圖

(5)正交因素水平試驗

根據以上單因素試驗的結論，乙醇的體積分數、料液比、超聲輔助時間和提取溫度這四個單因素都對溪黃草多酚的提取率均存在一定的影響。為了能進一步優化溪黃草多酚的提取工藝，在單因素試驗結果的基礎上，設計四水平正交試驗表，如表1。

表1 正交四水平試驗表

(6)正交試驗結果分析

表3 正交試驗結果方差分析表

根據實驗結果可知，不同因素對溪黃草多酚的提取結果影響有差異，其影響程度從極差和偏差平方和分析出來，當極差和偏差平方和越大時，說明它的影響程度越顯著。由表2可以看出，各個影響因素的顯著性先后順序為乙醇體積分數＞溫度＞超聲時間＞料液比。由直觀分析可以看出，乙醇體積分數對溪黃草多酚的提取影響更顯著。根據方差分析表，四個因素的F比以及F臨界值較為接近，說明試驗結果存在一定的誤差。綜上所述，溪黃草多酚的最佳提取工藝乙醇體積分數為75%，料液比為1:50，超聲輔助提取時間為30min，提取的溫度為35℃。以分析得出的提取最佳工藝條件進行重復性試驗三次，結果發現平均提取率與正交試驗中的最佳提取條件時的提取率基本一致，說明提取工藝方案具有一定的可行性。

表2 正交試驗結果記錄表

3.結論

綜上所述，隨著乙醇體積分數增大，溪黃草多酚的提取率先升后降，說明溶劑的體積分數過大，溶劑濃度越大，越不利于溪黃草多酚的提取；當料液比達到一定值時，溪黃草多酚已經被充分提取，再增加溶劑，反而會降低提取率，而且成本提高；超聲提取的時間過長，會破壞溪黃草多酚的結構，使溪黃草多酚的產率降低；而溫度在一定范圍內，對溪黃草多酚的提取有促進的作用，但溫度過高則會造成溪黃草多酚的分解。通過正交實驗結果分析，在乙醇體積分數為75%，料液比為1:50，超聲輔助提取時間為30min，提取的溫度為35℃時，溪黃草多酚的提取率可以達到最大值。