油菜素內酯對水稻耐旱性的影響研究

潘 根，姜 慧*，孫志廣

（1.中國農業科學院 麻類研究所，湖南 長沙 410205；2.江蘇徐淮地區連云港農業科學研究所，江蘇 連云港 222006）

水稻（Oryza sativa）是重要的糧食作物之一，養活了世界上超過一半的人口［1］。干旱是影響水稻等農作物生長和產量的主要非生物脅迫因素，嚴重威脅著糧食安全［2］。在干旱脅迫下，植株內部結構、生理指標及轉錄水平改變，如氣孔閉合、根系形態結構改變、滲透相關物質積累及抗性基因表達量改變，這些是應對干旱脅迫的重要策略之一，而植物激素在這個策略中發揮了重要作用［3］。

前人研究表明，脅迫相關激素如脫落酸（ABA）、乙烯（ETH）、茉莉酸（JA）等直接參與了植物的干旱脅迫反應。過表達ABA途徑相關基因PYL10、SnRK2、OsABA8ox3通過激活ABA信號途徑及增加ABA含量來提高水稻植株的耐旱性［4-6］。過表達乙烯（ETH）響應因子JERF1能夠增強水稻的耐旱性，主要通過增加脯氨酸含量、激活脅迫相關基因的表達以及降低水分流失［7］。外源噴施茉莉酸（JA）后能夠通過提高水稻SOD、POD等抗氧化酶的活性，從而提高植株的耐旱性，而過表達茉莉酸信號抑制子JAZ9能夠增加水稻對干旱的敏感性［8］。除了ABA、JA、ETH等脅迫相關激素外，生長素類激素如生長素（IAA）、細胞分裂素（CK）也被報道參與了水稻耐旱性的調控。過表達生長素信號相關基因，如OsPIN3t、OsIAA6等可以通過增加根系數目來增加水稻對干旱脅迫的耐性［9-10］。CK可以通過增加植株光合作用即碳同化能力來增強水稻的耐旱性［11］。此外，油菜素內酯（BR）也被報道參與了植株的耐旱反應［12］。在植株和小麥中，BR信號途徑相關基因BZR1正調控擬南芥的耐旱性，主要是通過提高滲透來保護代謝物含量及促進脅迫相關基因表達來提高植株的存活率［13-14］。與擬南芥、小麥研究結果相反，在番茄中，過表達BR受體基因BRI1降低了植株ABA的含量及SOD、POD酶活性，從而負調節植株的耐旱性［15］。但BR在水稻植株耐旱性方面的作用至今未有相關報道。為此，本研究通過對干旱脅迫下外源BL處理水稻植株進行耐旱表型鑒定、生理生化指標測定及脅迫相關基因表達量分析，初步闡明BR在水稻耐旱中的功能及其作用機理，研究結果對水稻抗旱栽培及耐旱新品種培育具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物 水稻品種9311來自連云港市農業科學研究院。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司，表油菜素內酯（BL）購自美國Sigma公司，Evo M-MLV反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自湖南艾科瑞生物有限公司，引物由湖南擎科生物科技有限公司合成。

1.2 水稻耐旱表型鑒定

水稻品種9311種子浸種催芽后，當出芽長約0.5 cm時，選擇活力一致的種子播種于直徑為10 cm的黑色營養缽中，每天保持正常澆水，植株培養至3葉1心時待處理。在BL對水稻耐旱性影響的研究中，首先將BL溶解于無水乙醇中，并稀釋至BL濃度為1 μmol（乙醇濃度為0.1%）后，再用噴壺對植株葉片進行外源噴施，噴至葉片有水滴落出后停止噴施。處理組為1 μmol BL，對照組為僅含0.1%乙醇水溶液，噴施1 d后進行干旱脅迫處理，7 d后進行植株存活率統計。每個處理3次重復。

1.3 RNA提取及基因定量分析

分別將供試材料浸種催芽，當種子出芽長約0.5 cm時，選擇活力一致的種子播種于直徑為10 cm的黑色營養缽中，每個營養缽播種25粒，每天保持正常澆水，待植株培養至3葉1心時停止澆水，分別于停止澆水時、停止澆水后第1、2及4天取植株根系組織冷凍后存儲于-80 ℃冰箱中待用。

用RNA提取試劑盒提取干旱處理植株根系組織總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度，用Nano Drop 2000超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific，USA）檢測其濃度和純度。

使用Evo M-MLV反轉錄試劑預混液將總RNA反轉為cDNA。選用OsActin為內參基因，在CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad，USA）上以SYBR Green I為熒光染料，反應條件為95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。用于基因定量表達分析的引物如表1所示。

表1 qRT-PCR所用引物

1.4 脅迫相關生理指標測定

分別提取干旱脅迫第2、第4天水稻品種9311的根系用于POD酶活性、SOD酶活性及MDA含量測定。POD、SOD酶活性及MDA含量測定具體方法參考南京建成生物有限公司生產的POD、SOD及MDA試劑盒說明書。葉片相對含水率測定步驟如下：首先剪取0.1 g水稻幼苗葉片，用錫箔紙包好后稱重記為鮮重FW，并將樣品置于烘箱100 ℃殺青1 h，然后80 ℃恒溫烘24 h后稱重，記為干重DW。每個處理3次重復。植物含水率公式為：

1.5 數據統計與分析

采用Excel 2010軟件進行數據分析和圖表繪制，利用SPSS軟件進行單因素方差分析，采用t檢驗進行干旱處理BR和ABA途徑相關基因表達量、外源BL處理與對照間存活率、鮮重及生理指標的差異性分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對BR途徑相關基因表達量的影響

為了探究BR在干旱脅迫響應中的作用，對干旱脅迫處理下水稻品種9311根系組織中BR途徑相關基因進行了表達量分析。OsBRD2、OsD2、OsD11為BR合成途徑相關基因，OsBRI1、OsBZR1為BR信號途徑相關基因。如圖1所示，干旱脅迫下，BR途徑相關基因表達量呈現出不同程度的下降趨勢，且在干旱脅迫處理第2、第4天，基因表達量顯著下降，特別在第4天的表達量最低，其表達量不到干旱脅迫處理前的一半。研究結果表明，干旱脅迫抑制了BR途徑相關基因的表達。

2.2 外源噴施BL對植株干旱脅迫的影響

鑒于BR途徑相關基因表達受到了干旱脅迫的抑制，為了進一步探究BR在水稻干旱脅迫響應中的作用，本文研究了外源BL噴施對水稻植株耐旱性的影響。如圖2所示，干旱脅迫第7天，外源噴施1 μmol BL處理植株存活率低于10%，而對照的存活率接近80%（圖2b）。研究還發現，干旱脅迫7 d后，對照植株的鮮重顯著高于BL處理的（圖2c）。這些結果表明，外源噴施BL增加了植株對干旱脅迫的敏感性。

2.3 干旱脅迫下外源BL對植株SOD活性、POD活性、MDA含量及相對含水率的影響

為了探究BR負調控水稻耐旱性的生理機制，測定了干旱脅迫2和4 d后BL處理及其對照的植株脅迫相關生理指標。如圖3所示，干旱脅迫處理2 d后，BL處理植株根系中POD活性顯著低于未處理植株的，其活性約為未處理植株的50%，而MDA含量顯著高于對照植株的；干旱脅迫處理4 d后，BL處理植株根系中POD活性、SOD活性及相對含水率均顯著低于對照植株，而MDA含量顯著高于對照，約為未處理植株的1.8倍。

2.4 干旱脅迫下BR對ABA途徑相關基因表達量的影響

據報道ABA能夠正向提高植物的耐旱性［4］。為了探究BR負調節水稻耐旱性的作用機制，對外源BL處理植株進行了ABA途徑相關基因表達量的測定。由圖4可知，干旱脅迫處理4 d后，BL處理植株根系中OsNCED5、OsABI5、OsABI3及OsbZIP23基因表達量均顯著低于對照植株，其中OsABI5、OsABI3及OsbZIP23的表達量約為對照植株的1/3。研究結果表明，BR負調控水稻的耐旱性可能與ABA途徑相關基因下調表達量有關。

3 討論

BR是一類生長素類激素，被廣泛報道參與了植物的生長和發育的調控［16］。前人研究也表明，BR參與了植物耐旱性的調控。外源噴施BL能夠提高擬南芥、番茄的耐旱性，過表達BR信號基因BZR也能夠提高小麥、擬南芥的耐旱性，這些研究表明BR能夠正向調控植物的耐旱性［13-14，17-18］。與之相反，在干旱脅迫下，BR合成及信號關鍵基因突變后，其植株存活率提高，暗示了BR能負調控植物的耐旱性［19-21］。本研究中，干旱脅迫抑制了BR途徑相關基因的表達，外源BL處理后增加了水稻植株對干旱的敏感性，表明BR能負調控水稻植株耐旱性，這與Northey等［22］的研究結果類似。

干旱脅迫能導致活性氧積累，使植物體內發生氧化脅迫，從而增加了膜脂過氧化物MDA的含量。作為植物耐旱的主要策略之一，植株通過SOD酶和POD酶清除植株體內多余的活性氧，從而減輕對植株的損傷［23］。番茄過表達BR受體基因BRI1后，植株SOD和POD酶活性下降，MDA含量上升，從而提高了植株對干旱的敏感性［15］。本研究也發現，BL處理植株中SOD和POD酶活性低于對照植株的，表明外源BL處理減弱了植株的抗氧化能力，同時MDA含量的上升也表明其植株受到比對照更嚴重的氧化損傷。

Nolan等［12］研究表明，BR主要通過與ABA相互作用來調控植物的耐旱性。本研究發現，在干旱脅迫下，ABA途徑相關基因在BL處理植株中的表達量均低于對照植株，通過進一步研究發現，BR對OsABI3和OsABI5的表達量影響最為顯著（圖4）。研究結果表明，OsABI3和OsABI5可能對BR負調節水稻耐旱性起到了關鍵作用。Liu等［24］研究表明，BR可以通過轉錄因子BZR直接結合OsABI5的啟動子區域來抑制基因的表達量，從而負調控植物的耐旱性，在水稻中BR是否通過這條路徑來負調節水稻耐旱性還需進一步研究。

4 結論

在干旱脅迫下，BR信號途徑相關基因的表達量受到抑制，外源BL處理降低了根系中SOD和POD酶活性，抑制了ABA途徑相關基因的表達量，導致根系中MDA含量的升高，葉片相對含水量降低，從而增加了植株對干旱脅迫的敏感性。本研究初步明確了BR在水稻耐旱性中的功能及作用機制，為水稻的抗旱栽培及育種研究奠定了理論基礎。