IL-32通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制胃癌細胞自噬

王雪梅，程 玉，齊潔敏

2020年WHO國際癌癥研究機構(IARC)最新數據顯示，胃癌的發病率和致死率均位居惡性腫瘤的第4位，病死率高達7.7%[1]。中國是胃癌的高發地區，約為全球平均水平的2倍，發現時常已為中晚期，治療手段較局限，且其轉移和復發率高，術后5年生存率僅為20%，嚴重威脅人類健康[2]。胃癌的發生機制錯綜復雜，不僅與異常增殖、凋亡相關，與自噬亦密不可分。自噬是一個維持細胞正常生理功能、促進DNA損傷修復、調節惡性腫瘤轉移，進而高度精確調控腫瘤形成的過程[3-4]。IL-32作為腫瘤微環境中的一種炎癥因子，與胃癌的發生、發展緊密相連，對于調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等具有重要作用[5]，但是否通過自噬影響此類現象還有待探究。本文旨在探究IL-32對胃癌細胞自噬的影響及可能的作用機制，為胃癌的精準治療開辟新路徑。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備CO2培養箱、超低溫冰箱、純水機(美國Thermo Scientific公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，電泳儀、轉膜儀及凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)，制冰機(日本SANYO公司)；搖床(北京六一生物公司)。

1.2 主要試劑人胃癌細胞株MGC-803、AGS、BGC-823、SGC-7901和正常胃上皮細胞GES-1購自中國科學院上海細胞庫。RPMI-1640培養基、DMEM/F12(1∶1)培養基、特級胎牛血清(美國Gibco公司)，IL-32 siRNA(廣州銳博生物公司)，轉染試劑Lipo3000(美國Invitrogen公司)，BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶公司)，GAPDH內參抗體(美國Cell Signal公司)，Goat Anti-Mouse IgG-HRP和Goat Anti-rabbit IgG-HRP(美國KPL公司)，IL-32、p-mTOR、mTOR、p-AKT、AKT抗體(美國Affinity Biosciences公司)、p110α、p85α、p62、Beclin1、LC3抗體(中國武漢三鷹生物公司)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養 本實驗選擇1株正常胃黏膜上皮細胞GES-1和4株胃癌細胞MGC-803、AGS、BGC-823、SGC-7901。其中GES-1、MGC-803、BGC-823、SGC-7901細胞使用10%RPMI-1640培養基，AGS細胞使用10%F12培養基，在5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。更換培養基依據細胞生長狀態而定，待細胞密度達90%以上時，根據實驗所需進行傳代、種板以及凍存，取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.3.2細胞轉染 轉染前一天下午將對數生長期的細胞接種至6孔板中，保證轉染時細胞密度在50%左右，按實驗設計分別轉染siNC、siIL-32#1及siIL-32#2組(siIL-32#1：5′-GGGAGAGCUUUU GUGACCA-3′，siIL-32#2：5′-CGGCUUAUUAUGAG GAGCA-3′)。稀釋轉染試劑：將4 μL Lipo3000試劑溶于125 μL無血清培養基中，室溫靜置5 min；稀釋siRNA：將7.5 μL siRNA儲存液溶于125 μL無血清培養基中，混勻，將稀釋后的siRNA加入稀釋后的轉染試劑中，靜置15 min。取前一天接種的6孔板，棄掉舊培養基，1 mL PBS清洗2次，每孔加入2 mL無血清培養基，再對應加入250 μL轉染復合物溶液，輕微搖勻，置于5%CO2、37 ℃的培養箱中培養，6～8 h后更換為10%的完全培養基繼續培養。

1.3.3免疫熒光技術 取轉染24 h后的細胞進行細胞爬片，將爬片置于24孔板中，分別對應加入100 μL細胞懸液，然后加入600 μL 10%完全培養基，置于5%CO2、37 ℃培養箱中培養24 h后取出，棄上清，PBS洗5 min×3次。預冷的4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗5 min×3次。2%BSA封閉液封閉2 h。棄封閉液，加入一抗LC3(稀釋比1∶50)，4 ℃孵育過夜。次日取出，PBS洗5 min×3次。孵育熒光二抗(稀釋比1∶100)，37 ℃避光孵育2 h，PBS洗5 min×3次。DAPI復染細胞核，室溫避光孵育5 min，PBS洗5 min×3次。進行封片，立即在熒光顯微鏡下進行拍照觀察。

1.3.4Western blot法檢測蛋白表達 收集轉染48 h后細胞，在冰上用細胞裂解液(RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1)，提取各組細胞總蛋白，蛋白濃度采用BCA法蛋白定量試劑盒進行測定，配好蛋白樣本后，100 ℃變性8 min。配制10%分離膠及5%濃縮膠，采用SDS-PAGE凝膠電泳，以30 μg/15 μL體系加樣進行電泳，175 mA轉膜1.5 h，5%奶粉或5%BSA封閉液封閉2 h，孵育一抗(抗體稀釋比1∶1 000)，4 ℃過夜。次日取出，TBST洗10 min×3次。二抗37 ℃孵育1 h(抗體稀釋比1∶10 000)，TBST洗10 min×3次。ECL超敏發光顯色試劑盒顯色，使用Image J分析灰度值。

2 結果

2.1 胃癌細胞系中IL-32的表達Western blot法檢測胃癌細胞系MGC-803、AGS、BGC-823、SGC-7901及胃正常上皮細胞系GES-1中IL-32的表達。與GES-1(0.704±0.024)相比，MGC-803(1.267±0.085)、AGS(1.269±0.047)細胞中IL-32蛋白明顯高表達，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。后續實驗均采用此兩株細胞進行基因沉默。

圖1 Western blot法檢測胃癌細胞株MGC-803、AGS、BCC-823、SGC-7901和胃正常上皮細胞株GES-1中IL-32蛋白的表達：與GES-1相比，MGC-803和AGS細胞中IL-32蛋白顯著高表達，***P<0.001

2.2 IL-32沉默效率為確保實驗的嚴謹性，應用Western blot法對轉染效率進行觀察和驗證。在MGC-803和AGS細胞中，與陰性對照組(siNC)(1.071±0.029、1.071±0.029)相比，siIL-32#1組(0.482±0.018、0.478±0.038)和siIL-32#2組(0.473±0.01、0.525±0.026)蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。后續所有實驗均在保證轉染效率的前提下進行。

圖2 Western blot法驗證siRNA轉染效率：與siNC組相比，siIL-32#1和siIL-32#2組蛋白表達水平顯著降低，***P<0.001

2.3 沉默IL-32基因對胃癌細胞自噬的影響MGC-803、AGS細胞分別轉染IL-32 siRNA，熒光顯微鏡下觀察并定量LC3熒光斑點。與siNC組相比，轉染siIL-32#1和siIL-32#2的胃癌細胞MGC-803和AGS細胞的LC3熒光斑點數量顯著增多，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。說明沉默IL-32基因可促進胃癌細胞發生自噬。

圖3 沉默IL-32基因對胃癌細胞自噬的影響：與siNC組相比，轉染siIL-32#1和siIL-32 #2的胃癌細胞MGC-803和AGS中自噬熒光斑點量顯著增多，***P<0.001

2.4 IL-32對自噬相關蛋白表達的影響轉染siIL-32#1和siIL-32#2的胃癌細胞MGC-803中p62的相對表達量為0.244±0.051和0.339±0.025，其在AGS細胞中的相對表達量(0.427±0.028、0.392±0.033)明顯低于siNC組(0.948±0.015、1.056±0.043)。Beclin1(MGC-803：0.783±0.047、0.921±0.021；AGS：0.973±0.034、1.085±0.082)、LC3-Ⅱ(MGC-803：1.080±0.015、1.006±0.024；AGS：0.826±0.083、0.777±0.174)與siNC組(MGC-803：0.948±0.015、0.948±0.015；AGS：0.647±0.039、0.223±0.038)相比表達升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖4)。

圖4 Western blot法檢測自噬相關蛋白的表達：與siNC相比，MGC-803和AGS細胞轉染IL-32 siRNA后，siIL-32#1組和siIL-32#2組p62表達降低，Beclin1和LC3-Ⅱ表達升高，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.5 IL-32對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響轉染siIL-32#1和siIL-32#2的胃癌細胞MGC-803中p-mTOR/mTOR的相對表達量為0.298±0.037和0.352±0.034，在AGS細胞中的相對表達量為0.492±0.011和0.425±0.039，明顯低于siNC組(0.870±0.032和0.933±0.052)。p-AKT/AKT(MGC-803：0.330±0.013、0.432±0.028；AGS：0.582±0.016、0.482±0.043)，p110α(MGC-803：0.714±0.022、0.901±0.030；AGS：0.504±0.023、0.550±0.008)，p85α(MGC-803：0.296±0.023、0.642±0.063；AGS：0.364±0.030、0.417±0.046)較siNC組(MGC-803：1.130±0.030、1.061±0.026、1.144±0.024；AGS：1.177±0.018、1.058±0.017、1.075±0.027)表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05，圖5)。

圖5 Western blot法檢測PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白的表達：與siNC組相比，MGC-803和AGS細胞轉染IL-32 siRNA后，siIL-32#1和siIL-32#2組p-mTOR、p-AKT、p110α、p85α表達水平明顯降低，而mTOR和AKT總蛋白水平保持不變或略升高，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

白介素(interleukin, IL)家族是人類機體免疫系統中重要的調節因子，由巨噬細胞、淋巴細胞、單核細胞和內皮細胞等多種細胞分泌而成，可根據其性質分為趨化因子、炎癥因子和其他因子三類，IL家族成員參與眾多炎癥性疾病和惡性腫瘤的形成。相關研究表明[6-8]，IL家族種類多樣，功能復雜，IL-1β可通過自噬作用調控非小細胞肺癌的形成；在膽管癌的預后治療中，IL-6可通過自噬過程發揮診斷作用；IL-12可促進肝細胞的凋亡和自噬，從而抑制肝癌的發生與發展；王麗華等[9]研究還發現，IL-17A可以通過調節自噬降低卵巢癌細胞的敏感性。

IL-32是IL家族中重要一員，位于人類第16號染色體上，由705個堿基對構成，相對分子質量為3.2×104，IL-32在惡性腫瘤的發生、發展過程中發揮重要的調控作用[5,10]。研究表明，IL-32在肺癌[11]、肝癌[12]、結直腸癌[13]、食管癌及胃癌[14]等惡性腫瘤中均呈高表達，但其具體的作用機制是否與自噬相關目前尚不清楚。炎癥和自噬與惡性腫瘤的發病機制均具有相關性，機體的適度自噬在能量代謝、免疫調控以及細胞分化過程中發揮重要作用，而自噬失調可導致細胞營養匱乏，無法發揮正常的生理功能，從而加速細胞死亡[15]。LC3是自噬的標志蛋白，在激活狀態下，LC3-Ⅰ會與磷脂酸乙醇胺結合成為LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ進一步與泛素結合支架蛋白p62結合形成復合物，導致自噬溶酶體不能被降解，自噬過程受損[16-17]。

為探索IL-32對胃癌細胞自噬的影響，本實驗選用2條siRNA鏈轉染MGC-803和AGS細胞，通過免疫熒光技術進行檢測，結果顯示：沉默IL-32可增加LC3熒光斑點的數量，促進胃癌細胞發生自噬；采用Western blot法檢測自噬相關蛋白結果顯示：與siNC組相比，siIL-32#1和siIL-32#2組p62表達降低，而Beclin1、LC3-Ⅱ表達升高。這些結果表明IL-32抑制胃癌細胞發生自噬。

PI3K/AKT/mTOR信號通路在抑制自噬調控過程中發揮關鍵作用[18]。PI3K/AKT信號通路是細胞發生自噬的重要調控途徑[19]，PI3K由p85調節亞基和p110催化亞基構成，PI3K可磷酸化AKT，進而激活下游基因mTOR，其是自噬信號通路的主要靶點，促進mTOR與自噬相關因子絲氨酸激酶1相互作用，最終觸發自噬[20]。本實驗通過Western blot法檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路上的PI3K亞基p110α和p85α以及下游蛋白p-AKT和p-mTOR，結果發現，與siNC組相比，轉染siIL-32#1和siIL-32#2組胃癌細胞的p-mTOR、p-AKT、p110α、p85α表達水平明顯降低。上述結果表明IL-32抑制胃癌細胞發生自噬，可能與PI3K/AKT/mTOR信號通路有關。

綜上，IL-32抑制胃癌細胞發生自噬，其機制可能與激活PI3K/AKT/mTOR信號通路有關。然而IL-32調控該信號通路的機制目前尚不明確，這是本課題組下一步要解決的重要問題。