彌漫大B細胞淋巴瘤中MYD88、CD79B基因特征與臨床病理及預后的關系

吳 燦，張大川，王 輝，雷 婷，史勇強，謝雯瑩，賈晨昊，李 青

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是最常見的成人淋巴瘤，占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%[1]，國際上標準的治療方案為R-CHOP[2]。盡管R-CHOP方案能夠顯著提高DLBCL患者的總生存期(overall survival, OS)和無進展生存期(progress-free survival, PFS)，但約40%患者表現為療效差、易復發轉移或疾病進展[3]。因此，深入探討其發生機制、尋找新的分子靶點成為亟待解決的問題[4]。本文檢測89例DLBCL中MYD88、CD79B基因突變，分析其臨床病理特征及預后的關系，旨在更好地了解基因突變在DLBCL中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2016年10月～2020年7月蘇州大學附屬第三醫院收治的89例DLBCL，其中男性30例，女性59例，年齡34～82歲，中位年齡65歲。納入標準：(1)病理明確診斷為DLBCL, 非特指型；(2)術前未進行放療或化療；(3)有完整的臨床信息及隨訪結果；(4)有足夠的組織樣本用于二代測序(next generation sequencing, NGS)檢測。

1.2 方法

1.2.1觀察指標 記錄患者入院治療時的年齡、性別、Ann Arbor臨床分期、國際預后指數(international prognostic index, IPI)評分、原發部位、血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平。

1.2.2免疫組化 所有標本經10%中性福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋，3～4 μm厚連續切片，行常規HE和免疫組化SP染色。一抗CD20(L26)、CD79a(MX076)、CD10(MX002)、BCL-6(MX042)、MUM1(MX093)、BCL-2(MX022)、c-MYC(EP121)、Ki-67(MXR002)、Cyclin D1(MX0078)、CD3(MX036)、CD5(MX052)、CD21(MX019)，均購自福州邁新公司。Hans分類將DLBCL分為生發中心B細胞(germinal center B-cell-like, GCB)型和非生發中心B細胞(non-germinal center B-cell-like, non-GCB)型[5]。c-MYC蛋白≥40%腫瘤細胞陽性及BCL-2蛋白≥50%腫瘤細胞陽性者為雙陽性[6]。Ki-67≥80%腫瘤細胞陽性為高增殖指數[7]。

1.2.3NGS法 用QIAGEN FFPE樣品DNA分離試劑盒從DLBCL石蠟包埋組織提取基因組DNA，進行PCR擴增反應，然后使用SPB磁珠分離純化PCR擴增產物。使用源奇生物公司淋巴瘤55基因試劑盒，于MiSeq測序儀測序(美國Illumina公司，型號Novaseq 6000)，使用標準化自動樣本管理與數據分析系統對原始數據進行過濾并進行生物信息學分析。

1.2.4療效評價 患者采用PET-CT進行療效評估，根據淋巴瘤國際協作組的評價標準，療效評價包括完全緩解(complete response, CR)、部分緩解(partial response, PR)、疾病穩定(stable disease, SD)、復發或進展(stable disease, PD)[8]。OS是指從確診為DLBCL到因腫瘤死亡或隨訪結束的時間；PFS是指從確診為DLBCL到腫瘤復發、轉移或病情惡化的時間。

1.3 統計學分析采用SPSS 26.0軟件進行統計學處理。計數資料的比較采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗，OS、PFS采用Log-rank進行生存分析。本組統計學比較均采用雙側檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫表型及基因突變89例DLBCL中(圖1A、B)，GCB型31例，non-GCB型58例；c-MYC/BCL-2雙陽性24例(圖1C、D)。89例DLBCL中，18例MYD88基因突變，突變率為20.2%(18/89)。最常見的突變位點為L265P，達56.5%(13/18)，V147A位點突變率為11.1%(2/18)，S243N、M182T及M33T位點突變率均為5.5%(1/18)。19例CD79B基因突變，突變率為21.3%(19/89)。CD79B Y196H、Y196S位點突變率為15.8%(3/19)，CD79B Y196X、Y196C位點突變率為10.5%(2/19)。CD79B Y196C、Y196N、Y196D、A16V、T509G、G135D、C550-1G>A、Tyr196Cys、Ala205fs位點突變率均為5.3%(1/19)。6例MYD88、CD79B基因雙突變，占6.7%(6/89)。

圖1 A.HE染色顯示：DLBCL腫瘤細胞體積較大，細胞核內可見2～3個小核仁，呈中心母細胞形態；B.腫瘤細胞CD20胞膜彌漫陽性，SP法；C.c-MYC陽性，SP法；D.BCL-2陽性，SP法

2.2 MYD88、CD79B基因突變及雙突變與DLBCL臨床病理特征的關系

2.2.1MYD88基因突變與DLBCL臨床病理特征的關系 non-GCB型DLBCL中，MYD88突變率(16/58，27.5%)顯著高于GCB型(2/31，6.5%，P=0.018)。不同淋巴結外部位中MYD88基因突變情況：原發睪丸100%(5/5)，卵巢100%(2/2)，大腿100%(1/1)，原發乳腺66.7%(2/3)，骨組織50%(1/2)，鼻咽部33.3%(4/12)，舌根25%(1/4)；未發現MYD88基因突變部位：胃腸道(0/9)，扁桃體(0/6)，頜下腺(0/3)，腮腺(0/2)，會厭(0/2)，腹腔(0/2)，胸腔(0/1)，甲狀腺(0/1)，脾臟(0/1)，腭部(0/1)，喉部(0/1)，臀部(0/1)。DLBCL淋巴結外組(15/59，25.4%)MYD88基因突比率高于結內組(3/30，10%)，兩組間差異無統計學意義(P=0.087)。BCL-2陽性組MYD88突變率(16/55，29.1%)高于BCL-2陰性組(2/34，5.9%)，兩組差異有統計學意義(P=0.008)。c-MYC/BCL-2雙陽性組中MYD88突變率(9/24，37.5%)顯著高于非雙陽性組(9/65，13.8%，P=0.030)。Ki-67增殖指數高與MYD88基因突變顯著相關，Ki-67增殖指數≥80%組中MYD88基因突變率(14/47，29.8%)高于Ki-67增殖指數<80%組(4/42，9.5%，P=0.018，表1)。

2.2.2CD79B基因突變與DLBCL臨床病理特征的關系 58例non-GCB型DLBCL中CD79B基因突變16例，占27.6%，31例GCB型DLBCL中CD79B基因突變3例，占9.7%，CD79B基因突變以non-GCB型為主，兩組相比差異有統計學意義(P=0.049)。Ki-67增殖指數高與CD79B基因突變顯著相關，Ki-67增殖指數≥80%組中CD79B基因突變率(15/47，40.5%)高于Ki-67增殖指數<80%組(4/42，9.5%，P=0.010，表1)。

2.2.3MYD88/CD79B基因雙突變與DLBCL臨床病理特征的關系 c-MYC/BCL-2雙陽性組中MYD88/CD79B基因雙突變率(5/24，20.8%)顯著高于c-MYC/BCL-2非雙陽性組(1/65，1.5%，P=0.006)。Ki-67增殖指數高與MYD88/CD79B基因雙突變相關，Ki-67增殖指數≥80%組中MYD88/CD79B基因突變率(6/47，12.8%)高于Ki-67增殖指數<80%組(0/42，0，P=0.048，表1)。

表1 MYD88、CD79B、MYD88/CD79B基因突變與DLBCL臨床病理特征的關系

2.3 療效比較58例患者采用R-CHOP方案治療4周期后初次評估治療效果，CR率為53.4%，PR率為36.2%，PD率為10.3%。非CR組MYD88基因突變率(12/27，44.4%)顯著高于CR組(3/31，9.7%，P=0.004)。4周期化療結束后進行中期評估，非CR組MYD88/CD79B基因雙突變率(5/27，18.5%)高于CR組(0/32，0，P=0.042，表2)；提示MYD88基因突變、MYD88/CD79B基因雙突變患者的中期療效評估時不易達到CR。

表2 MYD88、CD79B、MYD88/CD79B基因突變與療效評估的關系

2.4 生存分析89例DLBCL患者中位隨訪時間36個月(1～60個月)。2組生存分析結果顯示，MYD88基因突變組與非突變組患者2年OS分別為77.8%與76.1%，PFS分別為55.6%與70.4%，組間比較差異均具有統計學意義(P=0.034、0.021，圖2A、B)。MYD88/CD79B基因雙突變組與非雙突變組患者2年OS分別為42.9%與76.7%，PFS分別為33.3%與69.9%，組間比較差異均具有統計學意義(P=0.041、0.004，圖2C、D)。CD79B基因突變組與非突變組患者的2年OS分別為50%與78.3%，PFS分別為45%與71.4%，兩組差異無統計學意義(P=0.141、0.085)。進一步統計分析，MYD88基因突變組與MYD88/CD79B基因雙突變組OS和PFS差異無統計學意義(P=0.30、0.075，圖2E、F)。

圖2 DLBCL患者生存分析：A.MYD88基因突變組和非突變組OS；B.MYD88基突變組和非突變組PFS；C.MYD88/CD79B基因雙突變組和非雙突變組OS；D.MYD88/CD79B基因雙突變組和非雙突變組PFS；E.MYD88基因突變組和MYD88/CD79B基因雙突變組OS；F.MYD88基突變組和MYD88/CD79B基因雙突變組PFS

3 討論

DLBCL是一組臨床和生物學上均具有異質性的腫瘤[9-10]。雖然大部分患者獲得較好的療效，但30%～40%患者發生耐藥或復發[11]。Schmitz等[12]對574例DLBCL樣本進行外顯子測序、基于芯片的DNA拷貝數分析和372個基因的定向擴增重復測序，將DLBCL分為MCD、N1、BN2、EZB四個亞型。近期有學者提出LymphGen分型，即MCD亞型、BN2亞型、N1亞型、EZB亞型、A53和ST2亞型[13]。其中MCD型以MYD88和CD79B基因突變為主要特征，提示MYD88、CD79B基因突變在DLBCL發生發展、治療及預后評估中可能具有重要作用。

2011年Ngo等[14]首次報道MYD88基因突變在non-GCB型DLBCL中高達29%，而在其他亞型DLBCL中非常罕見。有研究報道MYD88基因在non-GCB型DLBCL中突變率為21.6%～31.2%，而在GCB型中突變率6.0%～9.7%[15-16]。本實驗結果顯示，non-GCB型DLBCL中MYD88基因突變頻率高于GCB型，組間差異有統計學意義。DLBCL中MYD88基因突變與發病部位顯著相關，好發于中樞神經系統、睪丸、皮膚、乳腺部位[17-18]。原發淋巴結內DLBCL中MYD88基因突變率低(0～38%，中位值10%)[19]。本實驗在排除了特殊類型的DLBCL后，研究顯示睪丸(5/5)、卵巢(2/2)、大腿(1/1)、乳腺(2/3)均顯示較高的MYD88突變率(66.7%～100%)，而淋巴結內MYD88突變率為10%。

Rovira等[20]報道MYD88突變型DLBCL中c-MYC/BCL-2雙陽性率顯著低于未突變型。Dubois等[21]報道non-GCB型DLBCL中BCL-2陽性更多見于MYD88突變者中，non-GCB型中c-MYC/BCL-2雙陽性及c-MYC單一蛋白陽性與MYD88突變均無相關性。本實驗中c-MYC/BCL-2雙陽性組的MYD88突變率(9/24，37.5%)顯著高于非雙陽性組(9/65，13.8%，P=0.030)。c-MYC/BCL-2雙陽性常見于non-GCB型且預后較差。此外，本實驗結果顯示，單一BCL-2陽性也與MYD88突變顯著相關，而單一c-MYC陽性與該基因突變無相關性。

CD79B是B細胞抗原受體(B-cell receptor, BCR)組成部分，BCR刺激酪氨酸磷酸化的級聯反應，激活BTK(bruton agammaglobulinemia tyrosine kinase)，促進Ca2+產生，激活蛋白激酶C。蛋白激酶C使CARD11磷酸化，形成CBM復合體，參與NF-κB信號通路[21-23]。CD79B在non-GCB型DLBCL中突變率為21%，而在GCB型中突變率為0.6%～3%[17]。目前，CD79B突變多發生于non-GCB型。本實驗中non-GCB型CD79B突變率(27.5%)高于GCB型(6.5%)，差異有統計學意義。研究報道MCD型多發生于non-GCB型，non-GCB型DLBCL患者中MYD88/CD79B雙突變率約11.5%，在GCB型中雙突變率約0.6%[24-25]。本實驗中non-GCB型DLBCL中MYD88/CD79B基因雙突變率(6/58，10.3%)，顯著高于GCB型(0/31，0)。

本實驗探討了MYD88、CD79B與MYD88/CD79B基因突變與DLBCL預后的關系，生存分析結果顯示MYD88、MYD88/CD79B基因未突變患者的2年OS和PFS均顯著高于突變患者(P<0.05)；但CD79B基因突變患者2年OS和PFS比較差異無統計學意義(P>0.05)。有文獻報道MYD88突變可引發IL-1受體相關激酶介導的NF-κB信號途徑激活，導致腫瘤形成，MYD88基因突變影響患者生存預后情況[26-27]，本實驗結論與之一致。DLBCL的分子分型中MCD型以MYD88和CD79B基因突變為主要特征，MCD型的生存率低于非MCD型患者，提示預后不良。

綜上所述，MYD88基因突變及MYD88/CD79B基因雙突變與DLBCL患者的治療反應相關。MYD88基因突變以及MYD88/CD79B基因雙突變DLBCL患者的OS、PFS比未突變患者低。本研究未行多因素分析，在未來的實驗中將進一步探討MYD88基因突變以及MYD88/CD79B基因雙突變是否為影響患者預后的獨立不良因素。