結直腸癌肝轉移灶的影像學特征與病理微形態學特點的關系

胡 贏，韋成江，龔 晗，賴 浩，趙 偉,2，馮 雁，林 源

“牛眼征”是結直腸癌肝轉移灶獨有的影像學特征，表現為增強CT門脈期腫瘤邊緣環形強化而中心區低密度，而原發性肝癌少有這一特征[1-2]。大多數學者認為影像學“牛眼征”的出現與其供血方式有關[3-4]。也有研究顯示，腫瘤病灶向正常組織過渡時其血流動力學發生明顯改變[5]。目前評價腫瘤血管生成的“金標準”是微血管密度(microvessel density, MVD)[6]，是評估多種腫瘤預后不良的指標，如肺腺癌[7]、非小細胞肺癌[8]及結直腸癌[9]。肝轉移瘤與原發性肝癌的微血管分布和組織密度差異尚未有明確研究。因此，本實驗分析肝轉移瘤與原發性肝癌中膠原纖維及CD31陽性微血管密度(CD31 positive microvessel density, CD31-MVD)的分布差異，探討影像學“牛眼征”形成的可能機制。

1 材料與方法

1.1 病例收集收集2013年1月～2019年11月廣西醫科大學附屬腫瘤醫院就診的32例結直腸癌肝轉移患者及32例原發性肝癌患者的腹部增強CT資料，同時收集患者手術切除腫瘤組織標本蠟塊和臨床病理信息。

1.2 試劑兔抗人多克隆抗體CD31(ab28364)購自美國Abcam公司；即用型快捷免疫組化MaxVisionTM2檢測試劑盒(KIT-5920)、DAB顯色液及免疫組化抗原修復緩沖液(EDTA法)(MVS-0098)購自福州邁新公司；Sirius Red天狼猩紅(S8060-5)購自北京索萊寶公司；蘇木精(71020784)購自國藥集團化學試劑公司。

1.3 天狼星紅染色組織蠟塊3 μm厚連續切片，65 ℃烘烤6 h，二甲苯脫蠟，無水乙醇梯度水化，去離子水洗去殘留的乙醇及其他物質，室溫風干。天狼星紅染色液A 4 ℃孵育過夜，次日室溫復溫30 min，去離子水洗去多余的染液，天狼星紅染色液B細胞核染色30 s，流動水沖洗5 min，蘇木精浸泡1 min，流動水沖洗。1%鹽酸乙醇分化3 s，去離子水沖洗后浸入PBS反藍，PBS沖洗，梯度無水乙醇脫水，二甲苯透明，晾干后封固。采用FAXtissue系統采集全景高清圖像。

1.4 免疫組化按上述方法烘烤、脫蠟、水化，去離子水洗去殘留乙醇，用EDTA法進行抗原修復，3%過氧化氫阻斷內源性抗體，PBS沖洗，滴加一抗兔抗人CD31多克隆抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜，次日室溫復溫30 min。根據即用型快捷免疫組化MaxVisionTM2檢測試劑盒進行二抗孵育及DAB顯色。蘇木精浸泡30 s，后續步驟同天狼星紅染色。

1.5 結果判讀天狼星紅染色：使用EVOS FL成像系統掃描成像系統(美國Thermo Fisher公司)對天狼星紅染色切片進行掃描(4倍鏡)。使用Image J軟件計算不同組織切片腫瘤區和邊緣區的平均光密度值(AOD值)，由兩名醫師獨立判讀，最終結果取兩人平均值。

CD31-MVD：參照Weidner校正方法，任何被抗體染色的單個內皮細胞或細胞團，不管是否形成管腔，只要與周圍微血管、腫瘤細胞和其他連接組織有清楚的界限，均判讀為一個可計數的微血管。由兩位病理科醫師于10×40倍鏡下在腫瘤邊緣區、腫瘤區各取3個視野，取其平均值為MVD值。

1.6 影像學資料使用開源軟件Syngo-FastView(https://www.siemens-healthineers.com/en-us/medical-imaging-it/syngo-special-topics/syngo-fastview)提取CT圖像(CT檢查使用Siemens Somatom Sensation 64層螺旋CT機)。腫瘤區影像出現邊緣部分或完全強化，中心不強化或低密度則記為(+)，其他表現記為(-)。由兩名影像專業中級以上職稱醫師閱片，按照定義標準對所有病例的影像資料進行判定并統計，兩人結果一致時取該結果，結果不一致時由第三名中級以上職稱醫師進行最后判定。

2 結果

2.1 臨床特征32例結直腸癌肝轉移中，男性26例，女性6例；平均年齡(63.0±4.3)歲；病變位于結腸20例，直腸12例，原發灶直徑(6.3±2.2)cm；有淋巴結轉移14例，無淋巴結轉移18例；有脈管內癌栓10例，無脈管內癌栓22例；肝轉移灶單發16例，多發16例；肝內轉移灶最大徑(3.1±0.8)cm；術前CEA濃度(6.9±0.6)ng/mL。32例原發性肝癌中，男性22例，女性10例；平均年齡(57.0±3.8)歲；腫瘤直徑(4.7±1.2)cm；有脈管內癌栓12例，無脈管內癌栓20例；術前AFP濃度(533±43.8)μg/mL。

2.2 影像學“牛眼征”陽性率比較“牛眼征”主要見于結直腸癌肝轉移患者，在原發性肝癌中較少出現，兩組患者比較差異有統計學意義(P<0.05，圖1，表1)。

圖1 CT示：A.結直腸癌肝轉移患者“牛眼征”陽性；B.原發性肝癌患者“牛眼征”陰性

表1 結直腸癌肝轉移、原發性肝癌影像學“牛眼征”對比分析[n(%)]

2.3 膠原纖維在結直腸癌肝轉移與原發性肝癌邊緣區與腫瘤區的分布差異天狼星紅染色結果顯示：原發性肝癌腫瘤邊緣區較腫瘤區的膠原纖維分布更密集(圖2A、B)，而結直腸癌肝轉移兩個區域的膠原纖維分布較為接近(圖2C、D)。通過對天狼星紅顯色強度(AOD值)進行定量分析發現，原發性肝癌邊緣區染色強度高于腫瘤區，差異有統計學意義(P<0.05)，結直腸癌肝轉移邊緣區的染色強度稍高于腫瘤區，但差異無統計學意義(P>0.05)。組間比較結果顯示：結直腸癌肝轉移患者腫瘤區染色強于原發性肝癌腫瘤區染色，差異有統計學意義(P<0.05)，但在邊緣區兩者染色強度相似，差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

表2 結直腸癌肝轉移、原發性肝癌邊緣區與腫瘤區天狼星紅染色AOD值對比分析

圖2 原發性肝癌、結直腸癌肝轉移灶天狼星紅染色：A.肝癌原發灶邊緣區；B.肝癌原發灶腫瘤區；C.肝轉移瘤邊緣區；D.肝轉移瘤腫瘤區

2.4 CD31-MVD在結直腸癌肝轉移與原發性肝癌中邊緣區與腫瘤區的分布差異通過對不同區域的CD31-MVD進行計數發現，結直腸癌肝轉移患者邊緣區的CD31-MVD高于腫瘤區，差異有統計學意義(P<0.05)；原發性肝癌組邊緣區與腫瘤區的CD31-MVD相似，差異無統計學意義(P>0.05)。組間比較結果顯示：結直腸癌肝轉移組邊緣區和腫瘤區的CD31-MVD均較原發性肝癌組高，差異有統計學意義(P<0.05，表3，圖3)。

表3 結直腸癌肝轉移、原發性肝癌邊緣區與腫瘤區CD31-MVD統計分析

圖3 原發性肝癌及結直腸癌肝轉移邊緣區、腫瘤區CD31染色，MaxVision法：A.肝癌原發灶邊緣區；B.肝癌原發灶腫瘤區；C.肝轉移瘤邊緣區；D.肝轉移瘤腫瘤區

3 討論

原發性肝癌和肝轉移瘤這兩種惡性腫瘤幾乎囊括了絕大部分常見的肝臟惡性腫瘤。兩者在影像學特征上具有非常明顯的差別[10]。本實驗比較了兩者影像學特征的不同，與其膠原纖維和CD31-MVD之間的關系。

膠原纖維是結締組織中分布最廣、含量最多的一種纖維，且腫瘤的硬度、包膜均與結締組織有關，在肝臟慢性疾病中如肝硬化、肝惡性腫瘤中均可出現膠原纖維等構成的細胞外基質所形成的纖維化[11-13]。本文作者首先考慮是否是組織密度差異造成了血流速度差異，繼而導致顯影劑滯留造成了“牛眼征”。通過天狼星紅染色標記膠原纖維的分布發現，無論是在原發性肝癌或結直腸癌肝轉移外周均包繞著密集分布的膠原纖維帶，且半定量分析結果顯示兩者差異無統計學意義(P>0.05)，且結直腸癌肝轉移邊緣區與腫瘤中間區的膠原纖維均有較強表達。根據膠原纖維定量分析和影像學表現，作者推測腫瘤中的膠原纖維含量和分布可能并不能引起其影像學的特征性表現。

血供的差異亦是影像學“牛眼征”的形成原因。本實驗采用免疫組化法對微血管標志物CD31進行檢測發現，結直腸癌肝轉移腫瘤邊緣區微血管分布多于腫瘤其他區域，原發性肝癌中微血管在邊緣區及腫瘤其他區域的分布基本一致。作者推測微血管的這種分布差異是否影響了血流分布范圍，導致造影劑聚集在血流豐富區從而在CT影像上表現為強化帶，或其影響血流速度造成造影劑分布的時差性，使得不同時期腫瘤組織與正常組織、腫瘤周邊與腫瘤中心區域出現不同血流比例和造影劑比例，從而在CT影像上表現為不同的強化程度，形成“牛眼征”。而原發性肝癌邊緣區與腫瘤區微血管密度的一致性及其供血主要來源于小動脈，使其在CT影像上表現為“快進快出”的影像學特點。

綜上所述，結直腸癌肝轉移瘤影像學的特征性表現可能與腫瘤周圍的膠原纖維分布無直接聯系；微血管在腫瘤邊緣區、腫瘤區的差異性分布可能是引起結直腸癌肝轉移、原發性肝癌的影像學特征性表現差異的原因之一，并且在一定程度上為現有的觀點提供了理論依據。本實驗影像學特征與病理微形態學改變的對比研究給了我們許多新的啟發，但關于結直腸癌的病理微形態學與其臨床現象和規律之間的關系，還有待我們進一步深入研究。