適宜制備濃香型大曲的植被生態評價研究

蒲吉洲，文 靜，廖 麗，楊澤明，李佳鑫，鄒永芳，陳識澳，青 倩

（1.舍得酒業股份有限公司，四川射洪 629200；2.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644005）

“曲為酒之骨”，大曲作為白酒生產不可或缺的糖化發酵劑，在為白酒發酵提供微生物的同時，也提供了大量的酶和原料物質，大曲的品質與白酒的品質和產量有著密切的關系。大曲是開放式生產，原料、空氣、工具、場地等生態環境中的微生物可以通過自然接種方式在曲坯上富集形成復雜微生物群落。目前大量研究表明，大曲的生產與環境中的微生物密切相關，例如不同的生產環境、地理因素等會造成大曲品質的差異；不同地區生產的大曲質量和微生物組成群落有較大的差異；不同季節、不同地域生產的大曲微生物群落不相同。目前有許多研究學者針對大曲與生產環境存在的關系開展了大量研究。唐玉明等對曲房上中下不同位置空氣微生物進行分析，發現空氣中酵母菌和細菌與大曲酸度呈顯著相關。Du在類似的研究中表示新大曲中有82 %的細菌來源于原料，10 %來源于室內地面，2%來源于室內空氣；生產工具、室內地面、室外地面共為新大曲提供了超過90 %的真菌。可見釀酒微生物除了來源于室內、原料、空氣等，還來源于室外地面。

《美國國家科學院院刊》上的一項研究結果表明，土壤微生物多樣性與作為凋落物的植物化學組分的多樣性存在正相關。土壤是生態環境的基礎，其物理化學性質、養分的有效性、區域氣候、植被類型等眾多環境因素會對土壤微生物群落結構和組成產生影響。如植被類型，它除了有維持生態系統物種多樣性、主導群落更新演替、加速群落植被恢復進程等多種功能，還可以通過凋落物和分泌物為土壤微生物提供營養，促進植物和微生物之間的協同進化，提升土壤微生物的多樣性。目前關于植被對制曲微生物的影響還鮮有報道。

因此，本試驗采用高通量測序、理化檢測、植被組成等對制曲植被、植被下土壤及制曲相關微生物進行分析，運用相關性、主成分、聚類分析探索濃香大曲相關微生物、土壤、植被組成之間的關聯。本研究以沱牌舍得制曲園區不同植被組成及土壤環境為研究對象，分析其微生物群落特征，土壤理化性質，分析影響土壤微生物分布的理化因素，并分析不同植被下與制曲相關的真菌、細菌。在此基礎上，進一步探究制曲微生物與植被的關系，以建立適宜濃香制曲的植被生態評價，為生態釀酒提供科學的指導。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：見1.2.1樣品采集部分。

試劑及耗材：氫氧化鈉、碳酸氫鈉、硼酸等（均為分析純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；重鉻酸鉀、高錳酸鉀、硫酸等（均為分析純），成都市科隆化學品有限公司。

儀器設備：AT-710 自動電位滴定儀，日本京都電子公司；UV-5100B 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；K1100 全自動凱式定氮儀、SH220F 石墨消解儀，濟南海能儀器股份有限公司；BSD-YZ2200 立式智能精密搖床，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；VeritiFAST 梯度聚合酶鏈式反應(polymerasechain reaction，PCR)儀，美 國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集

在制曲園區內根據植被組成設置5 個代表取樣圈(編號C1—C5)，每圈設置20 個取樣點，每個取樣點在1 cm范圍內采用“五點取樣法”采集10～20 cm 深度腐殖層土壤(并記錄植被組成)，立即混合成單個土壤樣品共20 個土樣。土樣過2 mm 篩后分成兩份，一部分自然風干，用于土壤物理和化學性質的測定；另一部分土樣用于微生物測序，土壤真菌測序區域為ITS1，細菌測序區域為V4。

1.2.2 土壤理化性質測定

土樣采用LU描述的標準土壤試驗方法分析。烘箱105 ℃烘干24 h后測定含水量和容重；pH采用離子交換法測定；有機質和有機碳采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定；全氮采用微量凱氏定氮法測定；速效磷采用鉬藍比色法測定；速效鉀采用比濁法測定。

1.2.3 生物信息學分析

使用FLASH(V1.2.7)對原始序列進行拼接，fastp(V0.19.6)對數據進行質控獲得優化序列，使用Qiime2 (v2020.2)對數據進行降噪(DADA2)獲得樣本中真實的序列信息ASV(Amplicon Sequence Variant)，基于ASV 代表序列信息和豐度信息，進行后續的物種分類學分析、群落多樣性分析等。物種注釋方法為bayes 法，注釋數據庫為Silva138（細菌）、Unite8.0（真菌）。

1.2.4 數據處理與統計

基于上述分析，可以了解到游客對現階段四川旅游團餐滿意度的綜合評價.本研究表明，在28個感知特征項中，每對變量的滿意度均低于重要性，配對t檢驗也證明各項特征值的重要性和滿意度之間存在著顯著差異，這說明游客對四川旅游產品中的旅游團餐績效表現各方面的滿意度感知較低，特別是菜品質量是影響游客滿意度的最主要因素.因此，在明確了應該優先改進的重點項目后，各利益相關主體不僅要采取具體措施來改善菜品質量，也要重視影響游客實際體驗的用餐環境及用餐服務，才能全面提升四川旅游團餐的游客滿意度，進而增強四川旅游產品的綜合競爭力.

使用SPSS22.0 進行方差分析、主成分分析、相關性分析，顯著水平設定為0.05；mothur 1.30 用于Alpha 多樣性指數分析，使用豐富度指數Chao 指數和多樣性指數Shannon 指數分析土壤微生物的alpha多樣性。

2 結果與分析

2.1 代表圈土壤理化指標

由表1 和表2 可知，各圈容重、水解性氮、過氧化氫酶、磷酸酶活性存在顯著性影響(P＜0.05)，其他指標差異性不大。

表1 代表圈層理化指標

表2 代表圈層理化指標

2.2 制曲車間植被組成情況

按照各圈取樣點植被組成的相似性，歸為10組，見表3。

表3 制曲車間主要植被組成

2.3 制曲相關微生物

2.3.1 制曲相關細菌

高通量測序在屬水平上共鑒定出16 種存在于大曲中的主要細菌。制曲相關細菌分別為不動桿菌屬()、放線菌屬()、桿狀細菌()、短芽孢桿菌()、棒狀桿菌屬()、腸球菌()、梭形桿菌屬()、乳酸桿菌()、奈瑟氏球菌屬()、嗜糖假單胞菌()、假單胞菌()、羅斯氏菌屬()、葡萄球菌屬()、糖多孢菌屬()、鏈(狀)球菌()、高溫放線菌屬()。其中假單胞菌()、乳酸桿菌()、高溫放線菌屬()相對豐度含量最高，為制曲相關優勢菌屬（見圖1）。

圖1 制曲車間土壤與大曲相關細菌及豐度變化

選擇主要制曲相關細菌與理化指標進行相關性分析，見圖2。由圖2 可知，芽孢桿菌屬()、高溫放線菌屬()、糖多孢菌屬()、短芽孢桿菌()與土壤有機碳、有機質、速效鉀、全氮含量正相關，與水解性氮、過氧化氫酶活性、容重負相關，此外這些制曲相關細菌與第三圈樣品分布相關性較高，第三圈主要植被組成分布為5 號（珊瑚樹，秤星樹），6 號（桂花，銀杏，沿階草）即芽孢桿菌屬()、高溫放線菌屬()、糖多孢菌屬()、短芽孢桿菌()與珊瑚樹，秤星樹，桂花，銀杏，沿階草關系密切；假單胞菌(）屬與水分含量、pH 值負相關，與有效磷含量、水解性氮、過氧化氫酶活性及容重正相關，與第五圈植被（松樹、柏樹）以及第二圈植被（紫薇，女貞，桉樹，南天竹）相關性密切。

圖2 細菌與理化指標進行相關性分析

2.3.2 制曲相關真菌

圖3 制曲土壤與大曲相關真菌及其相對豐度變化

選擇主要制曲相關真菌與理化指標進行相關性分析，由圖4 可知，交鏈孢屬()相對豐度與土壤pH 值顯著負相關，與水分含量、磷酸酶活性、過氧化氫酶活性有一定負相關，與其他指標相關性不強。鐮刀菌屬（）受第一圈（桂花，沿階草，臘梅，紫薇；紫薇，臘梅，沿階草，桂花，南天竹）和第四圈（沿階草，小香樟，桂花）樣品影響最大，與水分含量和土壤pH 值關系最密切。與水分含量、有機碳含量、有機質含量、有效磷含量有較強的正相關，并與第二圈（紫薇，女貞，桉樹，南天竹）、第三圈（珊瑚樹，秤星樹）植被分布關系密切。曲霉屬()與水分含量有較強的負相關，與其他指標相關性不強。附球菌屬()、假絲酵母屬()與容重、過氧化氫酶活性和pH 值有微弱的正向關系，與其他指標均是負相關，并與第一圈（桂花，沿階草，臘梅，紫薇；紫薇，臘梅，沿階草，桂花，南天竹）、第二圈（紫薇，女貞，桉樹，南天竹）和第三圈（珊瑚樹，秤星樹）植被關系密切。與容重有較強的正相關，與水分含量、有機碳含量、有機質含量有較強的負相關。主要受速效鉀、脲酶以及過氧化氫酶影響。毛孢子菌屬()與大多數理化指標有正向的關系。

圖4 真菌與理化指標進行相關性分析

2.4 不同植被下理化指標及微生物分布情況

2.4.1 不同植被下土壤理化指標

按照各圈取樣點植被組成的相似性，歸為10組，將植被相似的取樣點位土壤樣品用于分析。由表4 和表5 可知，有機碳、全氮、速效鉀在10 組植被組合下存在顯著性差異，說明不同植被組合對其影響大；磷酸酶活性、容重不存在顯著性差異；pH 值、水分、有機質、水解性氮等理化指標在10 組植被組合下有所差異但差異較小。

表4 10組植被狀態下理化指標

表5 10組植被狀態下理化指標

2.4.2 不同植被下真菌和細菌分布情況

由表6 可知，植被2 有最高的真菌多樣性，最適宜真菌生長，植被6 組成下細菌的多樣性最高，因此，十種植被組成中最適宜真菌和細菌生長的植被分別為：紫薇，臘梅，沿階草，桂花，南天竹；銀杏，沿階草為主。

表6 不同植被下真菌細菌多樣性指數及OTU數量

表7 統計了大曲相關真菌和細菌在不同植被下的豐度和頻率。7 號（黃桷樹，竹林）植被組成土壤下制曲相關真菌出現的頻率最高，其次是6 號、5號；7 號（黃桷樹，竹林）植被組成土壤下制曲相關細菌出現的頻率也是最高的，其次是3 號、2 號。就相關菌出現頻率而言，7 號（黃桷樹，竹林）植被組成最適宜大曲相關微生物的生長，2 號、3 號、5 號也較適宜大曲相關微生物生長。從豐度來看，10 號、6號、5號植被土壤相關真菌總豐度最高，4號、7號、9 號植被組成土壤相關細菌總豐度最高。綜合來看，5 號（珊瑚樹，秤星樹）和6 號（桂花，銀杏，沿階草）植被組成下，制曲相關真菌出現的頻率和豐度均較高；7 號（黃桷樹，竹林）植被下，制曲相關細菌豐度及出現頻率均較高。

表7 不同植被下制曲相關微生物出現頻率和豐度

2.5 制曲植被生態評價

2.5.1 主成分分析

對不同植被組成下的理化指標、微生物指標以及制曲相關微生物指標進行主成分分析。根據特征值大于1 的原則提取了6 個主成分，6 個主成分特征值分別為6.21、3.46、2.63、1.97、1.50、1.05，6 個主成分的方差貢獻率分別為34.49 %、19.19 %、14.60%、10.96%、8.33%、5.82%，累計方差貢獻率為93.4%，即這6個主成分能反映原始數據93.24%的信息量，因此可以將這6 個成分用于主成分分析。通過主成分分析得到表8 中的載荷系數，該系數能夠反應各指標影響程度，絕對值越大表明該變量的貢獻越大。

表8 主成分因子載荷矩陣

由表8 可知，主成分1 方差貢獻率為34.49 %，有機碳、全氮、磷酸酶活性在主成分1 上的載荷較大；主成分2 方差貢獻率為19.19%，制曲相關細菌出現頻率、pH 值、水解性氮含量在主成分2 上的載荷較大；主成分3 方差貢獻率為14.60 %，水分含量、有效磷、速效鉀含量在主成分3 上的載荷較大；主成分4 方差貢獻率為10.96%，制曲相關真菌、細菌豐度在主成分4 上的載荷較大；主成分5 方差貢獻率為8.33%，土壤細菌Chao 指數在主成分5 上的載荷較大；主成分6 方差貢獻率為5.82 %，脲酶活性在主成分6 上的載荷較大。將各指標主成分載荷除以相對應特征值開平方根（即特征向量），將得到的特征向量與標準化后的數據相乘，就可以得出主成分表達式。

主成分3、主成分4、主成分5、主成分6 得分計算方法同理(LH1'表示LH1標準化后的值)，見表9。

表9 主成分系數向量

根據公式計算各植被組成的主成分得分，把不同植被下的各指標標準化后的數據代入以上線性模型，可以計算出各類型植被分別在6 個主成分上的得分Zi。以各主成分的方差貢獻率為權重，根據以下評價函數計算綜合得分。

由表10 綜合評分可知，植被組成3 綜合評價得分最高，植被組3 成主要分布在制曲車間第二圈，植被組成7 得分第二。排行前5 的植被組成均與其環境土壤營養水平、微生物多樣性、制曲相關微生物出現頻率高的分布規律基本相符合，可見評價結果具有一定的參考價值。該評價結合了制曲相關微生物的分布，因此，各植被的得分高低能在一定程度上體現對于制曲活動的價值高低。

表10 制曲車間不同植被評價得分和排序

2.5.2 聚類分析

根據各植被綜合評價得分對各類型進行系統聚類，以歐氏距離5 將10 種植被進行聚類。由圖5可知，組合3（紫薇，女貞，桉樹，南天竹）、組合5（珊瑚樹，秤星樹）、組合7(黃桷樹，竹林)被歸為一類，與主成分分析結果一致，說明這三組植被有益于生態制曲。

圖5 制曲車間植被聚類分析結果

3 結論

研究結果表明，不同植被組下的土壤pH 值、水分、有機碳、有機質等理化指標都與濃香大曲真菌和細菌豐度等存在一定的相關性；10組植被下的土壤指標有機碳、全氮、速效鉀存在顯著性差異(P＜0.05)。綜合不同植被組成環境下制曲相關微生物出現頻數和豐度等，通過主成分析與聚類分析得出適宜濃香制曲微生態的植被生態：紫薇，女貞，桉樹，南天竹；珊瑚樹，秤星樹；黃桷樹，竹林。