姜黃素對肝細胞癌耐藥細胞上皮間質轉化的影響及分子機制研究

練維生 姚征 曹非 鄭屹峰

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）具有高復發、易轉移的特性[1]。盡管HCC的診斷與治療取得了重大進展，但癌細胞在抗癌藥物治療后敏感性和反應各不相同，多種抗癌藥物對耐藥細胞（如耐阿霉素的人HCC細胞HepG2/ADM）均表現出較差的抗腫瘤活性[2]。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是上皮細胞向間充質表型轉變的重要過程，與癌癥的轉移過程、耐藥性有密切關系[3]。姜黃素是一種多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、調節細胞生存等作用[4]。已有研究證明，姜黃素可以通過NF-κB通路抑制癌細胞的侵襲[5]，還具有抑制HCC發展和改善耐藥性的作用[6-7]。然而，目前關于姜黃素對HepG2/ADM細胞作用的相關分子機制研究尚不多見。因此，本研究就姜黃素對HCC耐藥細胞EMT的影響及分子機制作一探討，以期為改善HCC治療方式及耐藥現狀提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞 人HCC耐藥細胞HepG2/ADM購自廣州吉妮歐生物有限公司。

1.2 主要試劑 鋅指蛋白（Snail）過表達載體購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司；Lipofectamine 3000試劑購自美國Invitrogen公司；RPMI 1640培養基及FBS購自美國Gibco公司；姜黃素、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）購自美國Sigma公司；阿霉素購自深圳萬樂藥業有限公司；噻唑藍溴化四唑（MTT）、胰蛋白酶、多聚甲醛、PBS、Triton X-100、Hoechst 33342染色液均購自北京索萊寶公司；兔抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、NF-κB p65、Snail、活化因子蛋白-1（AP-1）、信號轉導因子和轉錄激活因子3（STAT-3）、cMyc、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）等一抗以及異硫氰酸熒光素偶聯的二抗均購自美國CST公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購自上海碧云天公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及轉染 將HepG2/ADM細胞培養置于含0.5 nmol/ml阿霉素的RPMI 1640培養基中，37℃、5%CO2環境中培養，2～3 d傳代1次。按1.5×106個細胞/孔的濃度接種于6孔板，取1.5 ml EP管依次加入250 μl Opti-MEM I、4 μg Snail過表達載體或空載；再取 1.5 ml EP 管，加入 250 μl Opti-MEM I、8 μl lipofectamine 3000轉染劑混勻，根據產品說明書進行后續操作。

1.3.2 細胞增殖能力檢測 采用MTT法。取對數生長期的細胞接種至96孔板（5×103個細胞/孔）培養24 h后，加入不同濃度（10、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L）姜黃素孵育48 h。在黑暗環境下，加入20 μl/孔MTT（5 mg/ml）處理4 h，加入150 μl DMSO處理10 min，記錄各孔細胞在490 nm處的吸光度值，計算細胞存活率。此步驟為預實驗，為了避免對后續實驗造成較大影響，本研究選擇姜黃素濃度20 μmol/L進行以下細胞功能學檢測。

1.3.3 細胞遷移能力檢測 采用劃痕實驗。將細胞用胰蛋白酶處理后接種至6孔板中（5×105個細胞/孔）進行培養，并通過20 μl無菌槍頭劃痕。洗去漂浮細胞后，加入無血清RPMI 1640培養基繼續培養24 h。在顯微鏡下觀察、拍照，記錄24 h前后的劃痕距離。

1.3.4 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell實驗。將細胞接種至包被有基質膠的8 μm Transwell上室，下室添加含姜黃素的15%FBS培養基。48 h后，通過棉簽刮擦上室殘留的細胞，下室內細胞通過4%多聚甲醛固定、0.1%結晶紫染色，在光鏡下觀察并記錄細胞侵襲個數。

1.3.5 EMT標志物及NF-κB/Snail通路相關蛋白表達檢測 采用Western blot法。經聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜封閉2 h；4℃過夜孵育一抗，二抗孵育90 min。通過化學發光顯影，利用凝膠圖像處理系統分析光密度值。以GAPDH為內參，計算EMT標志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail通路相關蛋白Snail、NF-κB p65、AP-1、STAT-3、cMyc等蛋白相對表達量。

1.4 統計學處理 采用Graphpad Prism 8.0統計軟件。計量資料以表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度姜黃素對HepG2/ADM細胞增殖的影響 隨著姜黃素濃度的升高，HepG2/ADM細胞存活率明顯降低（P＜0.05）；20 μmol/L為姜黃素處理的合適濃度，見圖1。

圖1 不同濃度姜黃素對HepG2/ADM細胞增殖的影響

2.2 姜黃素對HepG2/ADM細胞遷移和侵襲能力的影響 與HepG2/ADM組比較，HepG2/ADM+姜黃素組細胞遷移和侵襲能力均明顯減弱，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2。

2.3 姜黃素對HepG2/ADM細胞EMT標志物蛋白表達的影響 與HepG2/ADM組比較，HepG2/ADM+姜黃素組E-cadherin蛋白表達明顯上調，N-cadherin、Vimentin蛋白表達均明顯下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 姜黃素對HepG2/ADM細胞中上皮-間質轉化標志物蛋白表達的影響

2.4 姜黃素對HepG2/ADM細胞NF-κB/Snail通路相關蛋白表達的影響 與HepG2/ADM組比較，HepG2/ADM+姜黃素組NF-κB p65、Snail蛋白表達均明顯下調（均P＜0.05），AP-1、STAT-3、cMyc蛋白表達差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖4。

圖4 姜黃素對NF-κB/Snail通路相關蛋白表達的影響

2.5 姜黃素通過NF-κB/Snail通路抑制HepG2/ADM細胞EMT的驗證結果 在20 μmol/L姜黃素處理HepG2/ADM細胞的基礎上過表達Snail后，由姜黃素誘導的E-cadherin表達上調、N-cadherin和Vimentin表達下調均被逆轉（均P＜0.05），見圖5a；HepG2/ADM細胞增殖、遷移和侵襲能力均明顯增強（均P＜0.05），見圖5b-d。

圖5 姜黃素通過NF-κB/Snail通路抑制HepG2/ADM細胞上皮間質轉化的驗證結果（a：Western blot結果；b：噻唑藍溴化四唑法檢測細胞增殖能力；c：劃痕實驗檢測細胞遷移能力，×40；d：Transwell實驗檢測細胞侵襲能力，×200）

3 討論

HCC已成為全球癌癥相關死亡的主要原因。目前HCC的治療策略仍以手術、放療和化療為主，但患者的預后較差，尤其是對化療產生耐藥性的患者[8]。阿霉素是HCC的常規化療藥物，但腫瘤細胞對其產生的耐藥性嚴重影響了化療的效果[9]。因此，需要更深入研究HCC耐藥細胞的潛在分子機制。

EMT是一種可逆的細胞過程，通常伴隨細胞黏附破壞、遷移侵襲和轉移增加以及化療耐藥等現象出現[10]。經歷EMT的細胞會表現出上皮基因如E-cadherin、緊密連接蛋白1和閉合蛋白表達下調，而間充質基因如N-cadherin、Vimentin和纖維粘連蛋白表達上調。在大多數情況下，E-cadherin的丟失是EMT的標志[11]。EMT已被確定在包括HCC在內的癌細胞轉移和復發中發揮重要作用[12]。姜黃素是一種由姜黃根莖產生的化學物質，多項研究表明，姜黃素對肝、肺和腎纖維化等多種病理狀態具有潛在治療作用[13]。并有證據表明姜黃素對EMT有著潛在的調控作用，例如姜黃素可以通過上調miR-200c表達，進而下調細胞外信號調節激酶5來抑制結直腸癌的EMT過程[14]；通過ERK5/AP-1通路負調控香煙煙霧誘導的腎細胞癌EMT過程[15]。本研究結果顯示，姜黃素可以抑制HepG2/ADM細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，姜黃素

還能抑制N-cadherin和Vimentin蛋白表達，促進E-cadherin蛋白表達，對HepG2/ADM細胞的EMT具有顯著抑制作用。

研究表明，在參與EMT進展的幾個關鍵因素中，NF-κB至關重要。在此過程中，NF-κB可以誘導多種促進腫瘤EMT和轉移的轉錄因子，包括Snail、Twist和ZEB2[16]。其中，第一個發現的E-cadherin轉錄抑制因子是Snail[17]。由NF-κB介導的Snail轉錄激活在調節癌細胞中的EMT過程起重要作用，例如NF-κB/Snail信號通路被發現在芹菜素對人結腸癌細胞的EMT抑制過程中發揮作用[18]。腸內酯調節三陰性乳腺癌細胞中NF-κB/Snail信號通路以恢復TGF-β誘導的EMT[19]。本研究也證實姜黃素作用于HepG2/ADM細胞后會引起NF-κB/Snail信號通路中相關蛋白表達下調。此外，在HepG2/ADM細胞中過表達Snail后，可部分逆轉姜黃素對EMT的抑制作用，促進HepG2/ADM細胞增殖、遷移和侵襲，提示姜黃素可能通過影響NF-κB/Snail通路來抑制HepG2/ADM細胞的EMT過程。

綜上所述，本研究證實了姜黃素對HepG2/ADM細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，同時細胞EMT過程在一定程度上也被抑制，可能與姜黃素對NF-κB/Snail通路的抑制有關。本實驗僅為細胞層面的驗證，具有一定的局限性，后續擬從動物實驗對該分子機制進行更深一步的驗證。