長鏈非編碼RNA LYPLAL1-AS1對神經膠質瘤細胞侵襲和遷移能力影響的研究

姚瓊 吳國飄 葉紅于 莊才翔 林一均 鄒詣 鄭炎焱

神經膠質瘤是中樞神經系統常見的原發性腫瘤。高級別神經膠質瘤細胞生長迅速、預后差，多數患者在確診后1～2年內死亡[1]。在諸多腫瘤細胞侵襲和遷移的相關調控分子中，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是近年來受到人們關注的熱點[2]。對神經膠質瘤組織進行微陣列芯片測序分析發現，在神經膠質瘤組織中lncRNA LYPLAL1-AS1表達水平明顯低于瘤旁組織，但其生物學功能和作用機制仍不明確。本研究探討lncRNA LYPLAL1-AS1對神經膠質瘤細胞侵襲和遷移能力的影響，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料及分組 正常星形膠質細胞、神經膠質瘤細胞U87、U251均購自中國典型培養物保藏中心。攜帶熒光標記的LYPLAL1-AS1高表達慢病毒轉染U87細胞（LYPLAL1-AS1-OE U87）及U251細胞（LYPLAL1-AS1-OE U251）、陰性對照U87細胞（OEC U87）和U251細胞（OEC U251）均購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司（批號：bio-105821、bio-73585、bio-53915、bio-72947）。RPMI1640細胞培養基和血清購自美國Gibco公司（批號：PM150110）。Trizol試劑購自美國ThermoFisher公司（批號：15596026）。Takara逆轉錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司（批號：D6110A）。SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒購自凱杰生物工程（深圳）有限公司（批號：218073）。Matrigel基質膠和Transwell小室購自美國Corning公司（批號：Matrigel 354234）。引物、LYPLAL1-AS1全長及突變序列購自廣州RiboBio公司（批號：SIGS0015358）。膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）抗體購自美國Sigma-Aldrich公司（批號：MFCD00145904）。

1.2 實驗動物及分組 購自上海斯萊克實驗動物有限公司的雄性裸鼠，24只，體重（25.68±1.36）g，分為4組：LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組。每組6只。飼養于SPF級動物房，動物房溫度（22±2）℃，濕度50%～70%，每日白天和黑夜各12 h，提供足夠的飼料和水。本研究經醫院倫理委員會批準[倫審（2020）第（271）號]。

1.3 細胞培養、消化和傳代 將正常星形膠質細胞、神經膠質瘤細胞U87和U251分別設為正常星形膠質細胞組、U87組和U251組，在37℃、5%CO2的條件下，使用含10%FBS的RPMI1640細胞培養基進行培養，待細胞生長至融合度70%左右，使用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。另將LYPLAL1-AS1-OE U87、OEC U87、LYPLAL1-AS1-OE U251、OEC U251細胞設為 LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組進行細胞培養、消化和傳代，留作備用。

1.4 LYPLAL1-AS1表達水平的檢測 根據說明書步驟，利用TRIzol試劑從3組細胞中分離總RNA。使用Takara的逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄合成cDNA，利用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR（Real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR），檢測LYPLAL1-AS1表達水平。LYPLAL1-AS1引物序列為：5'-CTCACCAGCTGTGGCCTTTTA-3'和5'-CTGCTCCCCCTTTG CATGT-3'；內參基因β-actin引物序列為：5'-ACCGAGCGCGGCTACAG-3'和5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'。LYPLAL1-AS1的相對表達水平=LYPLAL1-AS1基因的表達水平/內參基因的表達水平。采用上述同樣方法檢測LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組4組細胞中LYPLAL1-AS1表達水平。

1.5 細胞侵襲和遷移數量的檢測 采用Transwell小室法。細胞培養消化后重懸，計數水平為2×105個/ml。將Matrigel基質膠與無血清培養基按照1∶8比例混合均勻，加入Transwell小室，在底部凝固后形成Matrigel凝膠層。小室下孔加入15%FBS RPMI1640細胞培養基，小室中加入200 μl無血清的細胞懸液，設3個復孔，48 h后采用4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，每孔計算5個視野中的侵襲細胞數。然后行遷移實驗，實驗步驟與侵襲實驗基本相同。觀測LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組細胞侵襲和遷移數量。

1.6 4組裸鼠顱內腫瘤細胞相對熒光強度檢測 將LYPLAL1-AS1-OE U87、OEC U87、LYPLAL1-AS1-OE U251和OEC U251這4組細胞，以PBS清洗重懸為2×107個/ml，接種于4組裸鼠。裸鼠麻醉后，將細胞注射至相應組別裸鼠顱內頂枕區，分別于第14天和第28天采用美國Perkin Elmer動物活體成像系統拍攝裸鼠顱內腫瘤生長情況、檢測相對熒光強度。

1.7 兩組裸鼠顱內腫瘤組織免疫組化的檢測 第40天取LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組各2只裸鼠，過量吸入乙醚處死，取腦組織于4%多聚甲酫固定、脫水、包埋并切片，采用GFAP抗體對腫瘤組織進行免疫組化染色，顯微鏡下放大100倍和400倍成像，觀察腫瘤細胞聚集、組織壞死或血管浸潤等情況。

1.8 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常星形膠質細胞組、U87組和U251組細胞LYPLAL1-AS1表達水平比較 qRT-PCR結果顯示，U87組和U251組LYPLAL1-AS1表達水平均低于正常星形膠質細胞組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖1。

圖1 正常星形膠質細胞組、U87組和U251組中LYPLAL1-AS1表達水平的比較

2.2 LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組LYPLAL1-AS1表達水平比較 qRT-PCR結果顯示，LYPLAL1-AS1-OE U87組和LYPLAL1-AS1-OE U251組LYPLAL1-AS1表達水平均高于OEC U87組和OEC U251組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖2。

圖2 LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組LYPLAL1-AS1表達水平比較

2.3 LYPLAL1-AS1-OE U87組、OEC U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組和OEC U251組細胞侵襲和遷移數量的檢測 LYPLAL1-AS1-OE U87組和LYPLAL1-AS1-OE U251組侵襲細胞數量均少于OEC U87組和OEC U251組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。LYPLAL1-AS1-OE U87組和 LYPLAL1-AS1-OE U251組細胞遷移細胞數量亦少于OEC U87組和OEC U251組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表1。

表1 4組細胞侵襲和遷移數量的比較

2.4 4組裸鼠顱內腫瘤細胞相對熒光強度的檢測 第14天LYPLAL1-AS1-OE U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組裸鼠顱內腫瘤細胞相對熒光強度與OEC U87組、OEC U251組比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。第28天LYPLAL1-AS1-OE U87組、LYPLAL1-AS1-OE U251組裸鼠顱內腫瘤細胞相對熒光強度均低于OEC U87組、OEC U251組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖3。

圖3 4組裸鼠顱內腫瘤細胞相對熒光強度的檢測

2.5 兩組裸鼠顱內腫瘤組織免疫組化的檢測 免疫組化染色顯示，OEC U87組腦組織腫瘤細胞呈長梭形或星形，組織內多出現壞死，腫瘤細胞常聚集，生長呈束裝或小團塊狀，且圍繞小血管呈局灶性浸潤生長，生長活躍。LYPLAL1-AS1-OE U87組腫瘤細胞呈長梭形或圓形，雖能見到細胞聚集，但多數細胞分布均勻，組織壞死程度和浸潤性較低，見圖4。

圖4 OEC U87組和LYPLAL1-AS1-OE U87組顱內腫瘤細胞的免疫組化染色圖（a：OEC U87組，×100；b：LYPLAL1-AS1-OE U87組，×100；c：OEC U87組，×400；d：LYPLAL1-AS1-OE U87組，×400；箭頭所示為腫瘤細胞聚集、組織壞死或血管浸潤等現象）

3 討論

近年來關于lncRNA的研究進展迅猛，雖然已證實lncRNA如Linc00475、lncRNA-THOR、lncRNA-EGFRAS1等的表達異常與神經膠質瘤進展高度相關[3-5]，但絕大部分lncRNA功能仍有待研究。新近對神經膠質瘤組織的微陣列測序數據表明，神經膠質瘤組織LYPLAL1-AS1表達水平明顯低于癌旁組織,而胰腺導管腺癌組織研究也發現，胰腺導管腺癌細胞的LYPLAL1-AS1表達水平明顯低于癌旁組織，提示LYPLAL1-AS1可能是重要的抑癌基因[6]。

本研究分析神經膠質瘤細胞LYPLAL1-AS1表達水平和生物學功能。結果證實，神經膠質瘤細胞中LYPLAL1-AS1呈低表達，可顯著抑制神經膠質瘤細胞侵襲和遷移，裸鼠原位接種實驗也證實LYPLAL1-AS1可抑制神經膠質瘤的生長。

雖然明確了LYPLAL1-AS1在神經膠質瘤的生物學功能，但其機制尚不清楚。在lncRNA調控腫瘤發生和發展中，由lncRNA、miRNA、mRNA以及假基因等構成的調控網絡即“競爭性內源RNA（competing endogenous RNAs,ceRNA）”是最為經典的致癌或抑癌調控機制之一[2]。ceRNA精確轉錄調控目的基因的表達依賴于lncRNA-miRNAs-mRNA三者之間的互作實現[7]。miRNA可通過互補序列結合在mRNA的3'-UTR，進而負向調控下游基因。本研究通過生物信息學預測方法，篩選到Lnc-LYPLAL1-AS1的一個潛在結合靶點miRNA217（miR-217）。有研究表明，miR-217的表達水平在多種腫瘤細胞系和腫瘤組織中均顯著上調，且具有致瘤作用。miR-217是參與包括淋巴瘤、骨肉瘤、胃癌、結直腸癌、乳腺癌等腫瘤發生、發展的致癌分子[8]。體外實驗揭示，miR-217上調表達將顯著增強癌細胞侵襲、遷移和增殖能力[9-10]。本研究的結果也證實，miR-217在神經膠質瘤組織中和神經膠質瘤細胞高表達。據此本實驗推測LYPLAL1-AS1在神經膠質瘤中的低表達，上調其表達水平將抑制神經膠質瘤細胞的侵襲和遷移現象，而這一調控作用可能是和miR-217有關。

酪氨酸3/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白γ（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein gamma polypeptide,YWHAG）則是miR-217下游調控靶點之一，其具有抑制神經膠質瘤細胞生存、增殖、遷移、侵襲和有絲分裂的功能，上調細胞miR-217水平可靶向降低YWHAG水平從而促進神經膠質瘤侵襲和遷移的進展[8，11]。YWHAG通過與含有磷酸絲氨酸的蛋白質結合而介導信號轉導，在包括細胞存活和凋亡，蛋白質運輸，以及細胞周期調節等細胞進程中發揮關鍵調控作用。已有研究表明，在神經膠質瘤細胞中，高表達YWHAG可誘導細胞凋亡并抑制細胞生長[11-12]。已有研究闡明，在U87神經膠質瘤細胞中miR-217靶向結合YWHAG mRNA，可抑制YWHAG的表達，同時逆轉YWHAG對U87細胞的抑制作用，促進U87細胞遷移、侵襲和增殖。基于已證實的miR-217與YWHAG的靶向結合特性，本實驗下一步計劃首先利用熒光素酶報告基因實驗驗證LYPLAL1-AS1與miR-217是否結合，以及探索LYPLAL1-AS1/miR-217/YWHAG三者之間的關系。

綜上所述，Lnc-LYPLAL1-AS1在神經膠質瘤的進展中發揮重要的抑癌作用，其作用機制可能是通過靶向調控miR-217/YWHAG表達，實現抑癌的功能。靶向調控Lnc-LYPLAL1-AS1的表達可能為神經膠質瘤的防治提供新的策略。