植物自噬的研究進展

楊玲鈺,張 蕾

(武漢大學雜交水稻國家重點實驗室,中國湖北 武漢 430072)

細胞自噬(autophagy)在真核生物中普遍存在,是一種依賴于溶酶體和液泡來降解細胞內物質或受損細胞器并回收必要營養物質的機制。目前,自噬被認為主要有巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和選擇性自噬(selective autophagy)3種途徑[1～2],其中巨自噬是最主要的自噬降解途徑。巨自噬首先由一系列ATG(autophagy-related protein)蛋白及相關蛋白質在吞噬泡組裝位點(phagophore assembly site,PAS)形成吞噬泡結構,進而吞噬胞內物質,產生具有雙層膜結構且直徑為400～900 nm的自噬體(autophagosome,AP),然后自噬體的外膜與溶酶體膜或液泡膜融合,內膜及內容物以自噬小體(autophagic body,AB)的形式被釋放到溶酶體或液泡中,并最終在一系列水解酶的作用下被降解和循環利用[3～4]。微自噬則不形成獨立雙層膜結構,其通過溶酶體膜或液泡膜的直接內陷將待降解物包裹并降解[5]。選擇性自噬是針對特異性的細胞成分,如細胞內需要清除的細胞器、大分子蛋白質復合體或入侵的病原菌等,由特定的分子伴侶蛋白(如HSC70和HSP90)介導的自噬途徑,形成過程與其他兩種自噬途徑不同[2]。

細胞自噬存在復雜的分子調控機制,參與植物的生長發育、衰老、環境脅迫應答及免疫反應等多種過程。本文綜述了近年來植物中細胞自噬的分子機制及生物學功能相關研究進展,旨在為植物細胞自噬相關研究提供參考。

1 植物細胞自噬的一般過程和分子機制

自噬的過程一般包括:自噬的誘導、泡狀結構的成核、自噬體的形成和自噬體與液泡膜融合(圖 1)。

在自噬過程中ATG蛋白發揮關鍵作用。擬南芥中已鑒定到的ATG基因有40種[6];水稻基因組中包含至少13個亞家族的33個ATG相關基因[7];此外,研究人員在煙草、玉米、蘋果等植物中也分離鑒定出ATG相關基因[8]。根據自噬過程中功能的不同,ATG蛋白可分為4大類:1)ATG1/ATG13蛋白激酶復合體——參與細胞自噬的誘導;2)磷脂酰肌醇激酶復合體(phosphatidylinositol 3-kinase complex,PI3K complex)——參與泡狀結構的成核;3)ATG9/2/18跨膜復合體(ATG9 complex)——參與自噬體形成和膜融合;4)類泛素結合系統(conjugation systems)——參與自噬體形成和膜融合[4](圖1)。

圖1 擬南芥自噬過程及核心復合物[4]Fig.1 The core autophagy machinery represented by the four main complexes in Arabidopsis thaliana[4]

1.1 細胞自噬的誘導

擬南芥中的ATG1/ATG13蛋白激酶復合體是自噬的核心組分,活性受上游激酶信號如TOR(target of rapamycin)激酶的調節。正常條件下,ATG13在TOR激酶復合體作用下維持高度磷酸化狀態,與ATG1的結合能力弱,抑制自噬的產生;當植物處于脅迫條件時,TOR激酶失活,ATG13發生去磷酸化從而與ATG1的結合能力增強,激活ATG1激酶活性,使其發生自磷酸化,然后ATG1/ATG13與ATG11、ATG101形成復合體并連接到自噬體膜上,促進自噬體到液泡的轉運[5]。研究表明,擬南芥SnRK1(sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 1,酵母Snf1和哺乳動物AMPK的同源物)在TOR通路的上游激活自噬[9],其可能通過影響ATG1蛋白的磷酸化參與自噬的正向調控[10]。新近研究表明,SINAT(seven in absentia of Arabidopsis thaliana)家族蛋白會促進ATG13的泛素化,從而調節自噬[11～12](圖 2)。

圖2 擬南芥自噬過程中ATG1復合體的作用機制[12]正常條件下,TOR激酶維持ATG13的高度磷酸化狀態,并與ATG1分離;TRAF1(tumor necrosis factor receptor associated factor 1)與SINAT1/2促進ATG13的泛素化和降解,使自噬通量維持在正常水平。脅迫條件下,SnRK1抑制TOR活性,導致ATG13去磷酸化,ATG1過度磷酸化,從而使ATG1與ATG13、ATG11、ATG101形成激酶復合物,啟動自噬。Fig.2 The mechanism of the ATG1 complex in autophagy in A.thaliana[12]Under normal conditions,TOR kinase complex maintains ATG13 in a highly phosphorylated state,and the phosphorylated ATG13 is disassociated from ATG1.Tumor necrosis factor receptor associated factor 1(TRAF1)and SINAT1/2 promote the ubiquitination and degradation of ATG13,thereby maintaining autophagy flux at normal cell level.Under stress conditions,SnRK1 inhibits TOR activity,leading to ATG13 dephosphorylation and ATG1 hyperphosphorylation,which forms a kinase complex with ATG13,ATG11 and ATG101 to initiate autophagy.

1.2 泡狀結構的成核

PI3K復合體介導囊泡成核。PI3K復合體被進一步區分為復合體Ⅰ和復合體Ⅱ,均含有3個核心蛋白質VPS34、VPS15和ATG6,此外復合體Ⅰ含有ATG14,而復合體Ⅱ含有VPS38。PI3K復合體和磷脂酰肌醇3磷酸鹽(phosphatidylinositol 3-phosphate,PI3P)負責從頭合成自噬體的修飾,PI3P招募ATG18-ATG2復合物到自噬體膜上,參與自噬體膜的延伸[13]。此外,PI3P也參與了自噬體沿著微管的轉運[14]。

1.3 自噬體的形成以及與液泡膜的融合

自噬體的形成過程包含自噬體的延伸和閉合。ATG9是自噬過程中唯一的跨膜蛋白,為自噬體的形成提供膜源。已有研究表明,自噬過程中ATG9會與自噬體膜發生短暫的膜關聯,調節植物內質網來源的自噬體形成[15];擬南芥ATG9與ATG11、PI3K共同調控ATG2介導的自噬體形成[16];ATG9還在ATG18a的轉運過程中發揮重要作用[15]。

ATG8脂化系統和ATG12蛋白結合系統在自噬體形成過程中共同發揮作用。在自噬過程中,ATG8和ATG12與ATG7(具有泛素活化酶E1活性)結合,然后分別轉移到ATG3和ATG10(具有泛素交聯酶E2活性)上,并最終與底物連接,其中泛素化折疊蛋白ATG8與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)結合,ATG12與ATG5耦聯形成復合物,幫助自噬體進行延伸和融合[17]。在這個過程中ATG8的C端被ATG4識別并剪切(圖3)。近期研究表明,H2S通過過硫化修飾抑制AtATG4a蛋白酶活性,從而負調控細胞自噬[18]。

圖3 擬南芥自噬過程中類泛素結合系統的作用機制[4]兩種類泛素結合系統作用下ATG5/ATG12和ATG8-PE復合物的形成過程。Fig.3 The mechanism of conjugation systems in autophagy in A.thaliana[4]Two ubiquitin-like conjugation systems prompt the formation of ATG5/ATG12 conjugate and ATG8-PE adducts.

研究發現,ATG5主要定位在內質網外表面,招募ATG8到已形成的自噬體。隨著自噬體的延伸,定位在自噬體膜邊緣的ATG5會形成一個環狀結構,當自噬體的膜封閉起來時,ATG5離開新形成的自噬體,并且脫離內質網[19]。

擬南芥中還存在一種含有BAR結構域的非ATG蛋白SH3P2(SH3 domain-containing protein 2),在自噬誘導之前,SH3P2被招募到PAS并與磷脂酰肌醇磷酸(phosphatidylinositol phosphate,PIP)、PI3K復合體及ATG8結合,促進膜的延伸或成熟,參與膜的變形過程,進而促進自噬體的形成[20]。

另有研究報道,酵母SNARE復合體介導自噬體和液泡融合形成自噬小體,導致內容物在液泡中降解[21];酵母YKT6在擬南芥中的同源基因RabG3b參與植物管狀細胞分化過程中的自噬,RabG3b-RNAi植株表現為細胞自噬缺陷[22]。

2 植物細胞自噬的生物學功能

2.1 自噬在植物生長發育中的作用

細胞自噬廣泛發生于植物生長發育的各個階段,在正常生長條件下,基礎水平的自噬對維持細胞內穩態是必需的。

自噬參與調控植物葉片衰老。大多數atg突變體表現為正常的胚胎發育和營養生長,但具有典型的自噬相關表型,即葉片早衰[23]。在擬南芥中,15個ATG基因在衰老過程中表達上調[24]。在玉米[25]、蘋果[26]、大麥[27]和大豆[28]中的研究也發現,ATG基因在衰老過程中表達增加。

自噬參與調控植物根的發育。研究發現,擬南芥中的細胞自噬可能參與根尖細胞生長及根毛分化[29]。此外,自噬在葡萄糖促進的根過氧化物酶體降解中發揮重要作用,并有助于葡萄糖介導的根分生組織的維持[30]。木胡楊的超微結構顯示,自噬體在木質部、韌皮部組織(包括木纖維和木外纖維)的分化和早期發育過程中積累,暗示自噬參與了根的發育[31]。

自噬參與調控種子的發育。在擬南芥種子發育過程中,大多數ATG基因在角果中表達上調[32]。水稻Osatg7-1突變體胚乳中的淀粉降解途徑被異常激活,種子呈白堊狀,且粒型小,淀粉含量低,暗示自噬在胚乳的代謝調節中發揮重要作用[33]。玉米和擬南芥的atg突變體相比于野生型都產生更少的種子,而擬南芥的ATG過表達植株則增加了自噬,提高了種子產量和油脂積累[25,34]。

自噬參與調控植物生殖發育。擬南芥atg6突變體表現為花粉發育異常[35]。水稻atg7、atg9突變體也表現為顯著的雄性不育,具體表現為在水稻花藥發育過程中,自噬相關結構(自噬小體等)在四分體時期的數量極低,而在單核期被顯著誘導[36];在Osatg7突變體中,多種與細胞器相關的基因以及參與碳水化合物/脂質代謝的基因的表達模式在花粉成熟過程中受到影響[37]。此外,有研究報道,煙草花粉萌發過程中需要自噬活動清除一些細胞質從而啟動正常萌發[38]。

自噬參與調控植物發育過程中離子的供給。在擬南芥中,自噬參與調控硫從蓮座葉到種子的代謝運輸[39]。在擬南芥atg5-1突變體種子形成過程中,鐵從營養器官到種子的轉運嚴重減少;鋅和錳在種子中的轉運也依賴于自噬[40]。另有研究發現,在提高植物對鋅的生物利用率以及缺鋅條件下植物維持活性氧穩態方面,自噬也發揮著重要作用[41]。

2.2 自噬在植物營養循環中的作用

植物細胞能夠在營養缺乏的情況下,通過自噬降解細胞結構或大分子物質,從而獲得游離的營養和能量。多數atg突變體表現為對營養缺乏敏感。

煙草幼苗經自噬抑制劑處理或者直接沉默ATG基因會產生過度積累的淀粉,該現象在擬南芥atg突變體中同樣存在,暗示自噬參與了植物淀粉的降解[42]。此外,過表達OsATG8a的植株在碳饑餓處理48 h時,OsATG1a/4a/8a/13a/16a和OsTOR基因的表達量均上調[43]。

研究發現,過表達MdATG18a促進自噬體的形成,增強了植物對氮缺乏的耐受性,并正調控花青素的生物合成[44];過表達MdATG9的蘋果愈傷組織也表現為對氮缺乏的耐受[45]。

HY5是光信號的關鍵成分,它與組蛋白去乙酰化酶9(histone deacetylase 9,HDA9)相互作用并調控ATG5和ATG8e的表達,從而調控植物在光-暗轉換和氮饑餓時的自噬作用[46]。

2.3 自噬在非生物脅迫中的作用

干旱會造成植物葉片氣孔關閉及氧化損傷。在擬南芥中,atg5、atg7和RNAi-ATG18a植株對干旱脅迫敏感[47～48];在自噬缺陷的小麥和番茄中,研究人員也觀察到類似的表型[49～50]。在蘋果中,ATG18a的過表達則提高了自噬活性和抗旱性[51]。近期研究發現,當植物遭受干旱脅迫時,作用于正常植物生長的COST1蛋白會被降解,從而激活自噬通路,抑制植物生長,增強植株抗旱性[52]。

高鹽是另一種植物易遭受的脅迫因子。水稻Osatg10b突變體對高鹽更加敏感,其自噬小體的數目顯著減少[53]。擬南芥atg對鹽和滲透脅迫都十分敏感,細胞中被氧化的蛋白質降解受損;此外,鹽脅迫下擬南芥的根皮層細胞中央液泡中Na+的限流需要自噬的調節[54]。

高溫脅迫會導致植物蛋白質發生錯誤折疊和變性。在番茄中,高溫誘導的自噬相關基因ATG5、ATG7、NBR1a和NBR1b在WRKY33a或WRKY-33b沉默植株中表達下調,同時,植株的耐熱性降低[55]。擬南芥atg在中度高溫(30℃)脅迫下幾乎完全雄性不育,高溫脅迫會誘導擬南芥中的花藥壁細胞和小孢子發生自噬,引起氧化損傷并抑制絨氈層的程序性細胞死亡(programmed cell death,PCD)[56]。

淹水會導致植物細胞缺氧和過氧化物積累。水楊酸(salicylic acid,SA)信號轉導突變體npr1和SA合成突變體sid2能夠完全或部分恢復atg突變體對淹水敏感的表型,暗示在淹水環境下細胞自噬可以通過調節SA的水平來保護植物[57]。近期有研究表明,淹水誘導的擬南芥根系自噬對根系中的PCD有抑制作用[58]。

2.4 自噬在植物免疫中的作用

植物在受到病原菌侵染時能夠激活自身的防御機制,通過侵染位點附近細胞的迅速壞死將病原菌限制在入侵部位,從而減少PCD,即誘導產生超敏反應(hypersensitive response,HR)[59]。自噬通過控制壞死細胞死亡的過程,并微調SA介導的免疫反應,影響植物基礎免疫[60]。

擬南芥WRKY33是植物抵抗壞死性病原體的重要轉錄因子,它與細胞核中的自噬蛋白ATG-18a相互作用,參與植物對壞死性病原體的反應[61]。棉花CLCuMV病毒的毒力因子βC1直接與自噬的關鍵蛋白質ATG8f在自噬小體中相互作用,進而導致βC1分解[62]。在煙草中,胞質甘油醛-3-磷酸脫氫酶(cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPC)通過與ATG3相互作用抑制自噬過程[63];而βC1可以阻斷GAPC-ATG3的相互作用,并與GAPC相互作用激活自噬途徑[64]。番茄TLCYnV復制啟動子蛋白C1與ATG8h直接相互作用,導致C1從細胞核轉移到細胞質,并通過自噬降解;自噬抑制劑處理或沉默ATG5、ATG7和ATG8h可促進茄科植物中TLCYnV的感染[65]。擬南芥中的BAK1(BRI1-associated receptor kinase 1)可以通過磷酸化ATG18a抑制細胞自噬途徑,從而削弱植物對灰葡萄孢菌的抗病性[66]。

綜上所述,自噬在植物生長發育、非生物脅迫及生物脅迫響應中都發揮著重要作用[67](圖4)。

圖4 植物細胞自噬的生物學功能[67]Fig.4 Biological functions of autophagy in plant cells[67]

3 總結

細胞自噬在營養物質缺乏或脅迫條件下對調節植物的生長十分重要,因此探究植物自噬分子機制意義重大。目前,植物細胞自噬研究取得了許多重要進展,很多研究方法也已成熟,但植物細胞自噬是一個復雜的過程,受到多種信號途徑和激素的調節,許多植物中的ATG相關基因還未發掘,自噬在植物中的更多生物學功能也還有待探究。未來,需要在植物中繼續分離鑒定新的自噬基因,從而更加清晰地闡明植物細胞自噬的分子機制。