妊娠期小鼠砷暴露對孕中期胎鼠腦組織全基因組mRNA表達(dá)的影響

王 匯，李冬晨，張 穎，邰大鵬

（包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040）

砷（arsenic，As）是國際癌癥中心公認(rèn)的人類致癌物。目前，全世界仍有多個地區(qū)暴露于富As環(huán)境中，暴露形式多樣，其中以飲水、燃煤和土壤As暴露為主［1］。As暴露可導(dǎo)致機(jī)體衰老、皮膚病變、肝癌、肺癌、膀胱癌和免疫系統(tǒng)病變等［2-4］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)同樣是As攻擊的重要靶器官。近年來大量研究表明，飲水性As暴露地區(qū)青少年學(xué)生智力與認(rèn)知水平明顯下降，出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)病變［5-6，19］。同時，動物實驗結(jié)果也表明，As可穿越胎盤屏障，蓄積于子代中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而對神經(jīng)發(fā)育造成影響，處于發(fā)育早期的神經(jīng)系統(tǒng)對外界有害物質(zhì)的毒作用較為敏感，更易引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷［7-8］。

Mo等［9］報道，長期As暴露可導(dǎo)致小鼠小腦和海馬組織代謝異常，長期低水平As暴露可導(dǎo)致海馬組織中神經(jīng)突觸的異常形成及小腦組織中神經(jīng)鞘的脫落。Dipp等［10］報道，一定水平As暴露可影響斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，引發(fā)神經(jīng)性病變。有研究發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期As暴露導(dǎo)致新生大鼠腦內(nèi)膽堿能和多巴胺能系統(tǒng)代謝異常［11］。Ram 等［12］報道，小鼠孕期及哺乳期As暴露后，其子代海馬椎體神經(jīng)元出現(xiàn)自噬和退化。盡管如此，妊娠期As暴露影響胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子機(jī)制仍不清楚，相關(guān)報道較少。

轉(zhuǎn)錄組測序（RNA transcriptome sequencing，RNA-seq）技術(shù)的出現(xiàn)為此項研究領(lǐng)域帶來了新契機(jī)和方向，RNA-seq技術(shù)可完整檢測某組織或細(xì)胞系中全基因組的表達(dá)。目前該技術(shù)已用于研究多種疾病相關(guān)差異表達(dá)基因［13-15］，但As暴露致胎鼠腦組織全基因組差異基因和作用途徑報道少見。RNA-seq技術(shù)為進(jìn)一步系統(tǒng)性探索As中毒分子機(jī)制提供了新的思路和方法。

為探討妊娠期As暴露是否影響胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，本研究用適當(dāng)濃度亞砷酸鈉（NaAsO2）溶液喂飲新受孕小鼠，并在受孕第12天（D12）對胎鼠腦組織進(jìn)行RNA-seq，分析胎鼠腦組織中全基因組mRNA表達(dá)水平，系統(tǒng)性分析As暴露損害胎鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子機(jī)制，以期為慢性As中毒影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分子機(jī)制研究及實現(xiàn)地方性As中毒疾病的早期防控提供新思路。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

NaAsO2，美國Sigma公司；RNA提取試劑盒、核糖體RNA去除試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，德國Qiagen公司；Trizol溶解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量檢測試劑盒，美國Thermo Fisher公司；Lightcycler 96實時定量PCR（real time-quantitative PCR，RT-qPCR）儀，瑞士Roche公司。

1.2 動物和分組

40只SPF級成年健康ICR小鼠，體重為18～25 g，雌雄各半，購自斯貝福實驗動物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0010。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按雌雄比1∶1進(jìn)行交配，每天觀察陰栓，查到陰栓之日視為妊娠D0。將孕鼠單籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分為正常對照組和As暴露組，每組10只。正常對照組每天自由飲用純凈水，As處理組自由飲用NaAsO275 μg·L-1水溶液。受孕D12處死孕鼠，取出胎鼠腦組織，稱重，置液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序

于孕D12處死孕鼠，分離胎鼠腦組織，將每只孕鼠所有胎鼠腦組織混合為一個樣本，從As暴露組和正常對照組各隨機(jī)挑選3只孕鼠處死，將每只孕鼠的胎鼠腦組織取出并混合成1個混合樣，共6組混合樣，委托南京派森諾有限責(zé)任公司進(jìn)行RNA-seq。利用組織RNA提取試劑盒提取腦組織總RNA，并用核糖體RNA去除試劑盒去除總RNA中核糖體RNA，再將RNA打斷成200～300 bp的片段，并保證接頭序列順利連接。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將片段RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA正鏈，再通過DNA合成生成雙鏈DNA。利用PCR技術(shù)富集片段生成文庫，對文庫進(jìn)行Agilent2100 Bioanalyzer質(zhì)量檢測，再將DNA打成單鏈片段，進(jìn)行illumina HiSeq高通量測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、過濾，去除其中的接頭及低質(zhì)量轉(zhuǎn)錄文本，獲得高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。采用DESeq對基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，篩選差異表達(dá)基因條件為：表達(dá)水平差異＞1（即|log2fold change|），P＜0.05。做熱圖（heat map）和MA圖，尋找差異基因，對差異基因做聚類分析，做GO功能分析確定差異表達(dá)基因主要生物學(xué)功能，同時也對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，篩選出差異基因富集信號通路。

1.5 RT-qPCR驗證測序結(jié)果的可靠性

為驗證測序結(jié)果準(zhǔn)確性，在測序結(jié)果中選取10個差異表達(dá)mRNA（|log2fold change|＞1，P＜0.05），包括2個上調(diào)表達(dá)基因fgf17h和cacna1f及8個下調(diào)表達(dá)基因hcn4，adcy8，cacng3，camk4，grp，gpr83，chrm2和grin10，利用Primer Primier5.0軟件設(shè)計特異性引物（表1）。使用Trizol法提取腦組織樣本中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用qPCR技術(shù)檢測差異基因表達(dá)水平。將RT-qPCR檢測的10個差異基因表達(dá)水平與RNA-seq結(jié)果進(jìn)行差異變化趨勢比較，以驗證RNA-seq結(jié)果可靠性。

Tab.1 Primer sequences used for real time-quantiative PCR（RT-qPCR）of differential genes

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，利用GraghPad8.0進(jìn)行統(tǒng)計分析與作圖，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測序樣本相關(guān)性檢驗

樣本間基因表達(dá)水平的相關(guān)性是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標(biāo)。為確保樣本差異表達(dá)分析的準(zhǔn)確性，在得到測序結(jié)果后進(jìn)一步進(jìn)行皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析。分析結(jié)果（圖1）顯示，樣本間基因表達(dá)水平相關(guān)性均＞0.8，表明本實驗樣本采集可靠有效。同時，As暴露組和正常對照組之間可見明顯差異。

Fig.1 Sample correlation test.The pregnant mice drank sodium arsenite （NaAsO2）aqueous solution 75 μg · L-1（in As treatment group，MB-test）or purified water（in normal control group，MB-contrast） freely from the first day of pregnancy（D0），and were killed at D12.The mixed samples of fetal brain tissue of 3 pregnant mice were collected in each group.The fetal brain tissues were taken for RNA transcriptome sequencing（RNA-seq）.The Pearson correlation coefficient was further analyzed.Red indicates high correlation coefficient and blue indicates low correlation coefficient.

2.2 差異表達(dá)基因可靠性驗證

RT-qPCR驗證結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，測序數(shù)據(jù)中10個差異基因的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)趨勢與RT-qPCR結(jié)果一致，差異倍數(shù)也與RT-qPCR結(jié)果相近，證明RNA-seq結(jié)果可靠。

Fig.2 Verification of differentially expressed genes by RT-qPCR.The ten differentially expressed genes were selected from the RNA-seq data for RT-qPCR detection to reveal their expression change and expression multiples to verify the accuracy and reliability of RNA-seq results.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with RNA-seq data.

2.3 差異表達(dá)基因的篩選分析

利用RNA-seq技術(shù)檢測分析發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，As暴露組胎鼠腦組織中165個基因mRNA表達(dá)上調(diào)，998個表達(dá)下調(diào)，差異表達(dá)基因共計1163個（圖3）。隨后篩選出部分與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)差異基因繪制柱狀圖進(jìn)行分析（圖4）。

Fig.3 Analysis of differentially expressed genes.A：heat map analysis of differentially expressed genes.The red indicates up-to-tune expression，the green indicates down-tuned expression，the black indicates unchanged.B：MA plot map analysis of differentially expressed genes.M：logarithmic ratio；A：average value.The red dot indicates the up-regulated genes in this group，the blue dot indicates the down-regulated genes in this group，and the grey dot indicates the non significant differentially expressed genes.MB-test is the brain tissue of fetal mice in arsenic treatment group，MB-contrast is normal control group.

Fig.4 Classificational analysis of differentially expressed genes related to nervous system development（A），oxidative stress（B）and apoptosis（C）.The differential genes closely related to nervous system development，oxidative stress and apoptosis were screened from total differentially expressed genes seen in Fig.3B，and the histogram was drawn.The screening condition was|log2fold change|＞1，P＜0.05.Adra2b：adrenergic receptor alpha 2b；f2rl2：coagulation factor Ⅱ receptor-like 2；oxtr：oxytocin receptor；grik3：glutamate receptor ionotropic kainate 3；oprl1：opioid receptor-like 1；gabra1：gamma-aminobutyric acid（GABA）A receptor subunit alpha 1；nts：neurotensin；gria1：glutamate receptor ionotropic AMPA1；htr2c：5-hydroxytryptamine（serotonin） receptor 2C；atp2b2：ATPase Ca2+transporting plasma membrane 2；sstr2：somatostatin receptor 2；mapk10：mitogen-activated protein kinase 10；atp1a3：ATPase Na+/K+transporting alpha 3 polypeptide；gabbr1：gamma-aminobutyricacid （GABA） B receptor1；pde1a：phosphodiesterase 1A calmodulin-dependent；slc25a37：solute carrier family 25 member 37；dusp5：dual specificity phosphatase 5；ptpn5：protein tyrosine phosphatase，non-receptor type 5；ntrk2：neurotrophic tyrosine kinase receptor type 2；ppp2r2b：protein phosphatase 2 regulatory subunit B beta；adcy8：adenylate cyclase 8；cdc25A：cell division cycle 25A.

2.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析

對As暴露組和正常對照組差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，將差異基因富集到相應(yīng)功能區(qū)域，結(jié)果表明（圖5A），在生物學(xué)過程方面，差異基因主要富集在神經(jīng)系統(tǒng)和行為發(fā)育、多組織發(fā)育和定位及信號傳遞和神經(jīng)刺激反應(yīng)等方面；在細(xì)胞組成分類中，差異基因主要集中在神經(jīng)突觸形成、細(xì)胞器和胞內(nèi)膜組成及細(xì)胞外基質(zhì)組成方面；在分子功能方面差異基因主要富集在信號傳遞、分子結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)活性方面。

Fig.5 Enrichment analysis of differentially expressed genes by GO（A）and KEGG（B）analysis.The red indicates the biological process module，the green indicates the cellular component module and the blue indicates the molecular funtion module in Fig A.The size of the dot in Fig B represents the ratio of the number of differential genes enriched in the pathway to the number of all genes annotated in the pathway，and the color represents the significant difference value of the pathway.

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

進(jìn)一步對差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，統(tǒng)計各個信號通路不同層級上包含差異表達(dá)基因的數(shù)目，進(jìn)而確定其主要參與代謝途徑和信號通路，進(jìn)行信號通路歸類分析。結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)，差異基因顯著富集于20個信號通路，其中包括與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)催產(chǎn)素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、尼古丁成癮、神經(jīng)活性配體受體相互作用及嗎啡成癮4個信號通路；神經(jīng)突觸傳遞相關(guān)谷氨酸突觸傳遞、唾液腺分泌、GABA突觸傳遞、多巴胺突觸傳遞、膽堿突觸傳遞、逆行性內(nèi)源性大麻素信號傳導(dǎo)、味覺傳導(dǎo)、心肌細(xì)胞中腎上腺素信號傳導(dǎo)和胃酸分泌9個信號通路；與細(xì)胞凋亡有關(guān)蛋白質(zhì)消化及吸收、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)3個信號通路及與氧化應(yīng)激相關(guān)絲裂原活化蛋白激酶信號傳遞、環(huán)磷酸腺苷信號傳遞、鈣調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和胰島素分泌4個信號通路。

3 討論

本研究采用構(gòu)建妊娠期As暴露胎鼠模型，收集特定胚胎發(fā)育期As暴露胎鼠腦組織進(jìn)行RNA-seq，探討As暴露對小鼠胚胎神經(jīng)毒性作用的分子機(jī)制。而后對RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾及皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析。結(jié)果表明，As暴露組與正常對照組胎鼠腦組織樣本間基因表達(dá)水平相關(guān)性很高（均＞0.8），證明本實驗樣本可靠性強(qiáng)，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

為進(jìn)一步探索妊娠期As暴露對胎鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響，本課題組分析As暴露組與正常對照組胎鼠腦組織RNA-seq結(jié)果，采用DESeq對基因表達(dá)進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)，2組樣本基因表達(dá)差異明顯，且主要富集在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)突觸傳遞、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等方面。由此，本課題組預(yù)測，妊娠期As暴露很可能通過提高氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡水平影響胎鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。這與文獻(xiàn)［9-10］報道研究結(jié)果相似。Nandita等［16］報道，細(xì)胞分裂周期 25A（cell division cycle 25A，cdc25A）基因為體內(nèi)細(xì)胞周期主要調(diào)控因子，As暴露會下調(diào)cdc25AmRNA水平，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯而致使A498腎細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡。本研究中，使用RNA-seq技術(shù)對全基因組測序結(jié)果顯示，As暴露組和陰性對照組胎鼠腦組織中cdc25A基因表達(dá)有顯著差異，與上述結(jié)果一致。

對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要富集在神經(jīng)系統(tǒng)和行為發(fā)育、多組織發(fā)育和定位、信號傳遞和神經(jīng)刺激反應(yīng)、神經(jīng)突觸形成、細(xì)胞器和胞內(nèi)膜組成、細(xì)胞外基質(zhì)組成及信號傳遞、分子結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等方面。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)口As染毒后，與正常對照組相比，As暴露組小鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力下降；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突觸后致密體厚度變薄和突觸間隙變寬［17］。Ram等［12］發(fā)現(xiàn)，孕期As暴露可誘導(dǎo)小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元軸突消失、細(xì)胞萎縮、細(xì)胞漿空泡變性、核溶解和固縮。當(dāng)溶質(zhì)載體家族25成員21（solute carrier family 25 member 21，SLC25A21）蛋白基因表達(dá)異常時，會導(dǎo)致線粒體呼吸鏈缺失，代謝異常，引起以脊髓運(yùn)動神經(jīng)元和骨骼肌運(yùn)動障礙為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變［18］。RNA-seq結(jié)果同樣顯示，As暴露組與正常對照組胎鼠腦組織SLC25A21mRNA表達(dá)差異明顯，且GO富集分析顯示，包括SLC25A21在內(nèi)大量差異表達(dá)基因富集于線粒體組成方面，證實As暴露影響了SLC25A21的差異表達(dá)，從而引起線粒體功能障礙，進(jìn)而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。N-甲基-D-天門冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)離子型門控通道谷氨酸受體，在學(xué)習(xí)與記憶中發(fā)揮關(guān)鍵作用，當(dāng)As暴露后會引起NMDAR重要內(nèi)源性激動劑D-絲氨酸含量減少，從而影響NMDAR偶聯(lián)離子通道開放，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶功能［19］。本研究通過GO分析發(fā)現(xiàn)，在生物過程方面，差異基因明顯富集于細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等功能區(qū)域，尤其是離子跨膜通道區(qū)，同樣確證了以上結(jié)論。

本研究通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，As暴露誘導(dǎo)胎鼠腦組織差異基因明顯富集于與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路上。有研究報道，MAPK信號通路與神經(jīng)損傷密切相關(guān)［20-22］，本研究中，RNA-seq結(jié)果同樣顯示大量差異基因富集于MAPK信號通路，進(jìn)一步證實As暴露后誘導(dǎo)神經(jīng)損傷。唐強(qiáng)虎等［23］證實，慢性As暴露后引起神經(jīng)元丟失，線粒體功能破壞，同時激活MAPK信號通路，也與本次測序結(jié)果相一致。

本研究提示，妊娠期As暴露引起胚胎腦組織毒性作用可能是通過提高氧化應(yīng)激水平、促進(jìn)神經(jīng)元凋亡和影響神經(jīng)突觸而實現(xiàn)，其具體分子機(jī)制有待深入研究。