玉米小曲酒糟發酵飼料對育肥豬腸道菌群的影響

王松 簡曉平 潘婉舒 張永光 王濤 游玲

（1. 宜賓學院固態發酵資源與利用四川省重點實驗室，宜賓 644000；2. 四川省宜賓高洲酒業有限責任公司，宜賓 645178；3. 宜賓學院農林與食品工程學部，宜賓 644000）

作為我國重要的生豬養殖基地，西南地區特別是四川盆周山區廣泛種植玉米，其主要用途是直接用作豬飼料，同時也催生了在縣鄉一級大量分布的以玉米為原料的小曲酒生產作坊。這些作坊一般以整粒玉米蒸煮后加入根霉、酵母，按照川法小曲酒工藝固態發酵7-10 d后蒸餾，出酒率在50%左右（折合53%vol白酒計），僅相當于玉米理論出酒率的一半左右。因此小曲發酵后的玉米酒糟與生產食用酒精后的玉米酒糟有很大差異，小曲酒糟玉米粒形態較為完整，且富含淀粉、玉米胚芽蛋白、微生物菌體蛋白、微生物活性代謝產物等，具有較高飼用價值，可直接用于生豬養殖。這些作坊一方面以15 000-18 000元/t為當地中低端白酒市場提供“包谷酒”，另一方面以700-800元/t為當地養殖業提供玉米酒糟飼料，基本實現了零固廢排放。但玉米小曲酒糟經過蒸餾后活菌均已死亡，不能起到補充腸道益生菌的作用，且營養不夠均衡，還需要添加其他飼料才能滿足生豬營養需求，增加了養殖過程中的繁瑣程度及勞動力投入。因此，在玉米小曲酒糟中添加糧食及其他輔料，通過復合菌劑發酵生產全價育肥豬飼料成為當前鄉村勞動力缺乏情況下的較優選擇。

目前，無抗益生菌發酵飼料是我國飼料產業的主要發展方向，已有菜籽粕［1］、構樹［2］、秸稈［3］、酒糟［4］等多種原料用于發酵飼料的生產，其發酵方式以固態發酵為主［5-6］。與普通飼料相比，發酵飼料除提供必要的大量或微量營養物質外，其最大的特色在于通過添加益生菌發酵產生多肽［7］、多糖等多種活性成分以改善動物健康狀況［8］，促進增重，改善肉質。目前，豬發酵飼料的研究主要包括新發酵原料的應用［9-10］、中草藥［11-12］及飼料酸化劑［13］等輔料的添加，發酵菌種選育［14］、益生菌及其活性產物作用機制［15-16］等方面的研究，但多數研究成果由于應用效果不穩定、經濟性較差、工藝復雜等原因未能轉化應用。

在前期研究中，本課題組開發了一種玉米小曲酒糟全價飼料發酵技術，用于育肥豬飼養效果較好，因此，本研究通過探討該全價發酵飼料對育肥豬腸道微生物的影響，初步揭示其影響育肥豬生長的主要機制，為該技術在生豬養殖中的進一步完善和推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米小曲酒糟全價發酵飼料（以下簡稱發酵飼料）：1 658 kg玉米小曲酒糟，添加玉米粉1 720 kg、豆粕560 kg、其他輔料56 kg及由干酪乳酸菌、釀酒酵母、黑曲霉、枯草芽孢桿菌組成的復合菌劑2 kg，混勻后按照40 kg /袋裝入呼吸袋，常溫發酵5 d后備用。

育肥豬：36頭平均體重（116±2）kg的外三元育肥豬，由本地養豬場提供。

1.2 方法

1.2.1 飼喂實驗 隨機選擇36頭體重接近的育肥豬，分成兩組，分置于兩個面積50 m2左右的圈舍，其中18頭采用養殖場自配的玉米-豆粕型日糧（以下簡稱常規飼料），另外18頭飼喂發酵飼料（表1），自由采食，連續飼喂47 d，期間觀察豬皮膚、毛色、神態等外觀形態以及糞便顏色、氣味。

表1 試驗飼糧組成及營養水平（干物質基礎）Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets（dry matter basis）%

1.2.2 育肥豬體重及飼喂飼料重量 飼喂前后，采用地磅對各組的18頭育肥豬分別稱重后合并取平均值（kg/d）。每天每個組分2次共添加36 kg飼料，自由采食后稱重剩余飼料重量，計算每天1頭育肥豬的平均采食量（kg/d）。

1.2.3 豬肉品質分析 采用常溫烘干法測定豬肉水分［17］，采用鮮樣浸提法測定肌內脂肪含量［18］，根據參考文獻［19］用pH計對豬肉進行預處理及pH測定。

1.2.4 飼料中微生物計數 采用許東梅［20］的方法，對飼料中細菌菌落總數、乳酸菌、酵母菌和霉菌分別進行計數。

1.2.5 腸道細菌區系分析 宰殺后，用無菌取樣方法將同一組育肥豬結腸和小腸內容物分別混合成一個樣品，則有對照組結腸混合樣品（Colctl）、對照組小腸混合樣品（Intctl）、發酵飼料組結腸混合樣品（Coltmt）、發酵飼料組小腸混合樣品（Intmt）共4個樣品，裝入無菌取樣袋-80℃保存，用干冰送樣至北京微生態公司，采用土壤基因組DNA提取試劑盒（FastDNA SPIN kit for soil）提取總DNA，以338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） 及 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）為引物，采用ABI GeneAmp? 9700型PCR儀擴增其16S rDNA部分序列，獲取PCR產物，并回收純化，利用Illumina MiSeq PE300平臺對測序樣本進行雙端測序，利用QIIME軟件對測序序列進行質控［21］。對獲得的OTU，選取代表性序列，與Greengenes Database 13.8數據庫（按99%序列相似性聚類）進行比對獲得物種注釋信息［22］，并基于物種注釋信息，去除葉綠體、線粒體以及不能注釋到界級別的OTU及其包含的序列。采用Mothur Version v.1.30.1 進行多樣性分析［23］并對菌群代謝功能進行預測及功能差異性分析［24-25］。

1.2.6 數據處理與統計分析 生長性能和理化數據結果采用 SPSS 22.0 軟件包中的 One-way ANOVA 程序進行單因素方差分析，采用 Duncan 氏法進行多重比較，以 P＜0.05為差異顯著性標準。

2 結果

2.1 發酵飼料微生物數量分析

發酵飼料中微生物計數結果表明（圖1），發酵飼料菌落總數、乳酸菌數、酵母菌數均顯著（P＜0.05）高于對照組，而兩組間霉菌數量無顯著差異（P＞0.05），甚至發酵飼料組還略低于對照組，可能與飼喂環境中霉菌在常規飼料富集有關。

圖1 兩種飼料中微生物群落結構比較Fig. 1 Structure of microbial community in two kinds of experimental diets

2.2 發酵飼料對育肥豬增重及肉質的影響

使用常規飼料和發酵飼料飼喂的36頭育肥豬增重情況如表2所示，統計分析表明二者平均日增重、平均日采食量均沒有顯著差異（P＞0.05），但發酵飼料組料重比顯著低于對照組（P＜0.05），降低了4.01%。同時，在日常觀察發現，飼喂發酵飼料的育肥豬皮膚色澤更紅潤有光澤，圈舍內臭味明顯少于對照。比較宰殺后的生豬肉（表2），發現兩個組的豬肉水分含量、肌內脂肪及pH均無顯著差異（P＞0.05），但取樣現場我們發現發酵飼料組育肥豬肝臟色澤紅潤均勻，而對照組顏色偏暗、偏紫。

表2 發酵飼料對育肥豬生長性能和肉質的影響Table 2 Effects of fermented feed on the growth performance of growing-finishing pigs and quality of pork

2.3 發酵飼料對豬腸道細菌多樣性的影響

從表3可以看出，與常規飼料組相比，發酵飼料組豬小腸和結腸中檢測到的細菌序列條數和OTU數量均有所增加，特別是小腸增加幅度明顯，其檢測到的序列條數增加了165.6%，OTU數量增加79.7%，在一定程度上表明飼喂發酵飼料可增加腸道細菌的細胞數量和種屬數量，且小腸比結腸的增加更加明顯；另一方面，不管是常規飼料組還是發酵飼料組，結腸內的細菌OTU數量均低于小腸，可能是由于一些在小腸細菌群體中豐度較低的OTU進入結腸后逐漸衰亡所致。從小腸和結腸內的細菌α-多樣性來看，不管是飼料類型，還是取樣部位，對細菌菌群多樣性均沒有顯著差異（P＞0.05），但飼喂發酵飼料后小腸的shannon指數和simpson指數均小于結腸，也小于常規飼料組的小腸，與序列條數和OTUs結果相反。

表3 發酵飼料對育肥豬腸道菌群α-多樣性的影響Table 3 Effects of fermented feed on the intestinal microbial alpha diversity of growing-finishing pigs

進一步對各組各部位OUT數量分析發現（圖2），有16個OTU在發酵飼料組和常規飼料組的結腸和小腸中均有出現，可能這16個OTU是豬腸道中的核心菌群。發酵飼料組結腸（Coltmt）和常規飼料組結腸（Colctl）共有74個OTU，發酵飼料組小腸（Intmt）和常規飼料組小腸（Intctl）共有98個OTU。與之相反，Coltmt和Intmt僅共有28個OTU，Colctl和Intctl僅共有48個OUT。

圖2 發酵飼料對育肥豬小腸及結腸OTU的影響Fig. 2 Effects of fermented feed on the OTU of intestine and colon of growing-finishing pigs

采用Bray Curtis距離、Unweighted Unifrac距離和Weighted Unifrac距離均可用于比較不同樣品間的微生物群落構成（β多樣性）［26］，其中Bray Curtis距離和Weighted Unifrac距離是結合OTU的豐度信息和系統進化關系獲得的樣本間距離，對豐度較高的物種更加敏感，Unweighted Unifrac距離主要考慮物種的有無，對稀有物種比較敏感，其值越小均表示兩組樣品在物種多樣性方面存在的差異越小［27］。從圖3可以看出，飼料種類和取樣部位均可影響到育肥豬腸道細菌的β多樣性。當飼料種類相同（發酵飼料），小腸（Intmt）和結腸（Coltmt）細菌區系分別以Bray Curtis距離、Unweighted Unifrac距離、Weighted Unifrac距離計算的相似性指數為0.929、0.034、0.910；而當取樣部位均為小腸時，則發酵飼料組（Intmt）和常規飼料組（Intctl）的細菌區系三大相似性指數分別為0.854、0.093、0.785，取樣部位均為結腸時，則分別為0.429、0.075、0.624。該結果表明，飼喂發酵飼料后，相對豐度高的種屬表現出更大的差異性，且對育肥豬小腸細菌區系的影響大于結腸。

圖3 兩個組育肥豬腸道微生物β-多樣性分析Fig. 3 Beta diversity analysis of gut microbiota from two groups

2.4 發酵飼料對育肥豬腸道細菌種屬構成的影響

從圖4可以看出，發酵飼料對育肥豬腸道細菌種屬區系構成有明顯影響。對結腸細菌群落來說，常規飼料組和發酵飼料組的優勢種屬都是Unspecified Clostridiaceae和乳桿菌屬（Lactobacillus），分別為24.9%和29.0%、28.1%和13.7%。但與常規飼料組相比，發酵飼料組Unspecified_Lachnospiraceae、Unspecified_Clostridiales、密螺旋體菌屬（Treponema）、瘤 胃 球 菌 屬（Ruminococcus）、Unspecified_Ruminococcaceae、Unspecified_S24_7的豐度明顯增加，而梭菌屬（Clostridium）、鏈球菌屬（Streptococcus）的豐度明顯降低。

圖4 兩個組育肥豬小腸及結腸細菌種屬構成熱圖Fig. 4 Hot map of bacterial species composition of intestine and colon from two groups

發酵飼料對育肥豬小腸細菌群落的影響更大。發酵飼料組小腸伯克氏菌屬（Burkholderia）在群體中的豐度從2.7%增加至50.1%，另外羅爾斯通氏屬（Ralstonia）、草螺菌屬（Herbaspirillum）、Lactobacillus、Streptococcus的豐度等也有明顯增加，而布勞特氏菌屬（Blautia）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、芽殖菌屬（Gemmiger）、Clostridium、巨型球菌屬（Macrococcus）豐度明顯下降。總體來看，發酵飼料組育肥豬小腸中的優勢細菌從以厚壁菌門（Firmicutes）為主變成Firmicutes和變形菌門（Proteobacteria）共存，但這些變化對豬生長及健康狀況的影響還有待進一步研究。

從物種之間的相關性來看（圖5），相對豐度較高的種屬中，Bifidobacterium、Psychrobacter及Blautia與其他細菌種屬之間存在最為廣泛的互作關系，而發酵飼料組中相對豐度大幅增加的Burkholderia卻僅與少部分豐度較低的種屬如CF231和Turicibacter存在顯著負相關，推測Blautia、Bifidobacterium、Psychrobacter、Gemmiger、Clostridium、Macrococcus豐度下降可能與Burkholderia的增加并無必然聯系。

圖5 屬分類水平物種相互作用網絡圖Fig. 5 Interaction network diagram about classification level of genus

2.5 發酵飼料對育肥豬腸道細菌群落功能的影響

采用KEGG基于種屬變化預測育肥豬腸道細菌功能，以初步評估發酵飼料導致的豬腸道菌群功能變化。從圖6可以看出，兩個組育肥豬結腸細菌菌群功能差異較小，但發酵飼料對育肥豬小腸細菌菌群功能影響較大。在L1級別上，發酵飼料組育肥豬小腸細菌群體代謝功能及細胞轉化功能明顯提升，在L3級別上，發酵飼料組育肥豬小腸內與細菌運動蛋白、物質跨膜運輸、分泌系統、雙組分系統等相關的代謝功能有所增強，而包括氨糖及核糖代謝，核糖體合成，DNA合成相關的嘌呤、嘧啶及DNA修復蛋白相關代謝等卻相對減弱。

3 討論

本研究發現發酵飼料對育肥豬的增重并無顯著影響，而其他多個研究認為發酵飼料有助于育肥豬增重［28］，這可能是由于本研究采用的對照已經是該養豬場經過優化后的日糧配方，其增重效果已較好，但發酵飼料的價值主要不在于增重，而在于無抗和健康養殖［29］以及減少農村面源污染［30］等方面。另一方面，與對照組相比，發酵飼料組的料重比顯著下降說明應用發酵飼料喂育肥豬經濟效益比較好。本研究同時觀察到發酵飼料能夠相對改善豬圈舍環境，育肥豬外觀形態，宰殺后的肝臟色澤，甚至豬肉膻味也相對減少，猜測相對常規飼料，發酵飼料可能一方面營養更加均衡和更易消化吸收，另一方面對豬的肝臟功能有積極影響，后續可更加深入的研究發酵飼料消化率，以及對育肥豬肝臟酶活、血液生化指標、免疫功能等的影響。

樣品OTUs數量在一定程度上表明飼喂發酵飼料可增加腸道細菌的細胞數量和種屬數量，且小腸比結腸的增加更加明顯。細菌多樣性一般包括豐富度和均勻度兩個方面［31］，本研究發現飼喂發酵飼料后小腸細菌菌群雖然豐富度增加，但均勻度明顯減小，即少部分菌群相對豐度顯著增加，形成明顯的優勢菌群，表明發酵飼料主要通過影響各種屬細菌的相對豐度（均勻度）而不是各種屬的有無（豐富度）來影響其豬腸道細菌區系。β-多樣性結果也進一步表明，本試驗中因飼料種類不同所造成的育肥豬腸道細菌區系差異大于因取樣部位不同造成的差異，且發酵飼料對育肥豬小腸細菌區系的影響大于結腸。結合前面發現發酵飼料組豬肉膻味減少，一般膻味主要是由豬肉脂肪組織中的雄烯酮和糞臭素引起，而糞臭素（3-甲基吲哚）是在后腸內由微生物降解色氨酸產生的揮發性化合物［32］，推測正是由于發酵飼料組育肥豬腸道菌群改變導致減少此類化合物的生成。并且，不同發酵飼料對豬腸道微生物的影響也存在差異，如本研究發現玉米小曲發酵飼料主要影響小腸菌群，對結腸菌群影響較小，但張錚等［33］發現發酵飼料對生長育肥豬結腸微生物有重要影響。

從腸道菌群種屬構成來看，發酵飼料對小腸細菌區系的影響更大，其中Burkholderia顯著增加影響最為重要，該菌能夠促進磷元素的轉化代謝并產生大量有機酸［34］，特別是作為新型抗生素和生物活性次生代謝物來源方面顯示了巨大的生物技術潛力［35］，但在育肥豬腸道菌群的作用還不清楚。另外，發酵飼料中接種發酵劑沒有在腸道中發現對應種屬及變化，推測發酵飼料對育肥豬的影響，更多的是因為其積累了大量微生物代謝物尤其是短鏈脂肪酸，而不是微生物本身。總體來說，發酵飼料組小腸菌群的變化對育肥豬生長和豬肉品質的影響還有待進一步研究。然而，我們也發現Burkholderia與其他優勢菌群沒有顯著的相關性，而KEGG結果表明發酵飼料組小腸細菌群體的增殖在一定程度上有所削弱，推測發酵飼料可能抑制了小腸內Blautia、Bifidobacterium、Psychrobacter、Gemmiger、Clostridium、Macrococcus等土著細菌增殖，從而使其在群體中相對豐度下降。另一方面，發酵飼料組小腸內細菌群體通過調節信號傳導系統、營養物質運輸、產物分泌等功能以主動適應營養供給變化，如感受外界刺激，調節細胞生理代謝和行為的雙組分系統功能的增強，推測發酵飼料對育肥豬小腸細菌群落這一整體生態系統功能的影響主要在于通過改變細菌區系構成來強化物質代謝，而這又在一定程度上給細菌增殖帶來不利影響，下一步可以基于育肥豬生長性能、胴體品質和豬肉風味繼續深挖腸道菌群與物質代謝之間的相關性。

4 結論

本研究通過研究玉米小曲酒糟全價發酵飼料對育肥豬增重和腸道微生物的影響，發現發酵飼料對育肥豬增重無顯著影響，但對腸道菌群特別是小腸細菌區系有明顯影響，飼喂發酵飼料后育肥豬小腸優勢細菌從Firmicutes變成Firmicutes和Proteobacteria共存，主要體現為Burkholderia的增加以及Blautia、Bifidobacterium、Psychrobacter、Gemmiger、Clostridium、Macrococcus的減少，KEGG功能預測發現腸道細菌群體的代謝功能相對增強，增殖功能相對減少。