畜禽養殖糞污中典型致病菌的三重微滴式數字PCR定量檢測方法的建立

程深偉 張克強 梁軍鋒 劉福元 郜興亮 杜連柱

（1. 農業農村部環境保護科研監測所，天津 300191；2. 新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所，新疆石河子 832000）

隨著步入“十四五”發展的新階段，為尋求農業高質量綠色發展，畜禽養殖糞污資源化利用在我國受到了前所未有的關注。種養結合、糞污還田利用是其資源化利用的最主要方式之一，是解決養殖業污染問題的根本出路，也是踐行農牧業綠色發展的重要舉措［1］。但由于各地養殖業糞污無害化處理技術的參差不齊，畜禽糞污作為多種微生物的主要載體，其內含的致病菌不但會直接影響養殖動物的健康，也會通過各種渠道與人類接觸，造成公共衛生安全的危害［2］。因此，快速檢測養殖糞污中的食源性致病菌，判斷其無害化處理效果，開發建立更為高效、靈敏的檢測方法尤為重要。

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）是3種畜禽養殖糞污中常見的致病微生物。國家標準中對典型致病微生物的檢測采用傳統培養的方法，通過細菌選擇性培養基和生化試驗來鑒定、分離和計數樣品中的細菌數［3］。但傳統檢測方法存在著操作繁瑣、檢測時間長、準確度低等問題。

近年來，實時熒光定量PCR技術（quantitative real-time PCR，qPCR）也被用于養殖糞污中致病菌的檢測。其運用PCR反應體系，利用熒光信號的采集對整個PCR系統進行實時監測，最后通過繪制標準曲線對檢測樣品進行相對定量的分析［4］。此法大大縮減了檢測時間，準確度和靈敏度均有明顯提升，但也存在著對PCR反應體系要求高、只能進行相對定量值的測定等問題。

微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是近年來迅速發展起來的一種定量分析技術。與傳統qPCR技術不同，ddPCR不依賴擴增曲線的Ct值（循環閾值）進行定量，不受擴增效率的影響，也不必采用內參基因和標準曲線，具有較好的準確度和重現性，得以實現絕對定量分析［5-6］。與qPCR相比，ddPCR對核酸含量較低的樣品檢測準確率和靈敏度都明顯較高［7-11］。魏詠新等［12］設計了大腸桿菌O157：H7特異性引物、探針，并比較了傳統培養計數法、qPCR和ddPCR的定值效果。結果顯示，ddPCR檢測方法能夠有效提高病原菌檢出效率。Kelley等［13］使用ddPCR和qPCR對397個樣本進行金黃色葡萄球菌的定量檢測。結果表明，ddPCR的靈敏度高于qPCR。趙新等［14］建立了沙門氏菌數字PCR檢測方法，結果也證實了ddPCR檢測方法具有檢測快速、檢出率高和操作便捷等優點。

ddPCR具有明顯的技術優勢，其操作簡單，樣品消耗量少，在反應體系中提高了反應器的數量，可以將稀釋后的樣品溶液等分到幾十到幾十萬的微滴中，并保證微滴的均一性和表面穩定性，大大提高了ddPCR的靈敏度。且由于其通道和包含在微滴中的樣品模板沒有直接接觸，也減少了反應中交叉污染及模板的損失［15］。ddPCR的技術優勢關鍵在于實現了檢測的絕對定量，而對于目前廣為使用的多重定量PCR原理上亦屬于傳統的qPCR技術，因此不具備ddPCR的上述優勢。目前相關ddPCR研究方法主要集中在食品中致病微生物的檢測，且均為單重檢測方法［16-19］，針對畜禽養殖廢棄物中典型致病微生物的多重ddPCR檢測方法鮮見報道。

研究采用數字PCR（dPCR）技術中的主要檢測應用方法—ddPCR技術，建立起畜禽養殖糞污中典型致病菌的三重微滴式數字PCR檢測方法，實現對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌以及腸炎沙門氏菌的絕對定量檢測，以期為畜禽養殖糞污無害化處理和安全利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱法）（APEXBIO，中國）；細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，中國）；PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix，5×（Quantabio，美國）；Fluorescein sodium salt（APEXBIO，中國）；Sapphire Chip（Stilla Technologies，法國）。

1.1.2 儀器與設備 Naica?全自動微滴芯片數字PCR系 統（Stilla Technologies， 法 國 ）；Sapphire Chip（Stilla Technologies，法國）；微量分光光度計（Titertek-Berthold，德國）；生物安全柜（BIOBASE，中國）；電子天平（Sartorius，中國）；高壓滅菌鍋（SHENAN，中國）；超低溫冰箱（海爾，中國）；4℃高速離心機器（2-16 PKsigma，德國）；迷你水平電泳槽（BG-subMINI cell，中國）；紫外凝膠成像（Bio-Rad Gel Doc XR+ Bio-Rad，美國）；電泳儀（Power-pac-Bio-Rad，美國）。

1.1.3 實驗菌株 共有13株，其中沙門氏菌1株、金黃色葡萄球菌1株、大腸埃希氏菌（O157：H7）1株（詳見表1）、非目標菌株10株，既有購買于標準菌株保藏中心的標準菌株，也有本實驗室自己從樣品中檢出的陽性菌株。

表1 3種典型致病菌具體信息Table 1 Specific information on three typical pathogenic bacteria

1.1.4 引物探針 參考文獻［16，19-20］中目標菌株核酸的多對引物探針，進行單重熒光PCR擴增比較，篩選最佳引物探針。最佳引物、探針參考文獻及序列見表2，引物和探針由上海生物工程技術服務有限公司合成。

表2 三重數字PCR檢測3種致病菌的特異性引物Table 2 Specific primers for detecting three pathogens by triple droplet digital PCR

1.2 方法

1.2.1 致病菌基因組DNA提取 純菌DNA提取：菌種按1∶50（體積比）比例接種至5 mL NB，37℃培養24 h后，再次按1∶50接種，37℃培養8 h，取1 mL菌懸液做10倍梯度稀釋，各取1 mL使用細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取基因組DNA，測定DNA濃度，置于-20℃保存備用。

1.2.2 單重ddPCR的擴增 分別以金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌（O157：H7）、腸炎沙門氏菌的基因組DNA為模板進行單重ddPCR擴增，無菌超純水為空白對照。本研究所選的3組引物探針的退火溫度均為60℃，3種TaqMan探針的熒光基團選用吸光度分段差異較大的FAM、HEX和CY5，以利于建立多重微滴數字PCR反應體系。單重ddPCR反應體系 ：PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix，5×5 μL，Fluorescein sodium salt（1 μmol/L）2.5 μL，10 μmol/L引物上下游各 1 μL，探針 0.5 μL，模板 DNA 5 μL，dd H2O補足25 μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，45 個循環。

1.2.3 多重ddPCR的建立與優化 對3種目標菌株的引物、探針和擴增酶的使用量進行篩選和優化，將3組目標菌株的引物與探針組合進行ddPCR擴增，確定彼此間不會互相干擾。再對3組多重ddPCR體系的引物探針添加量進行篩選，經過確認后對25μL體系中擴增酶的使用量進行比較，確認最優多重ddPCR反應體系。

1.2.4 多重ddPCR特異性實驗 選取3種目標菌株的混合基因組DNA為陽性對照，10株非目標菌的DNA作為陰性對照，進行三重ddPCR特異性檢測，并設立空白對照作為質量控制。

1.2.5 多重ddPCR靈敏度試驗 將含有3種目標菌株的基因組DNA進行1∶1∶1混合，進行10倍梯度稀釋，稀釋至106倍。使用6個梯度稀釋樣本進行三重微滴數字PCR靈敏度檢測，確定其檢出限。

1.2.6 畜禽養殖廢棄物中3種致病菌的檢測 在天津市某養豬場和某養雞場采集廢棄物樣本，共16份。稱取3 g樣本，按照糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱法）提取DNA，測定A260/A280、A260/A230、DNA濃度。隨后采用本研究所建立的三重ddPCP檢測方法對畜禽養殖廢棄物中3種典型致病菌進行定量檢測。

2 結果

2.1 單重ddPCR擴增結果

3種典型致病菌的單重ddPCR擴增效果良好，空白對照未出現陽性微滴。3對引物探針的退火溫度一致，適合構建多重ddPCR反應體系，見圖1-圖3。

圖1 腸炎沙門氏菌單重ddPCR檢測一維圖Fig. 1 One-dimensional diagram of single ddPCR detection of S. enteritidis

圖3 大腸埃希氏菌單重ddPCR檢測一維圖Fig. 3 One-dimensional diagram of single ddPCR detection of E.coli

2.2 多重dPCR的優化

通過體系優化與實驗比較，3組引物探針之間不會產生非特異性擴增，3種發光基團不會互相干擾或者干擾很少，單重ddPCR擴增所得拷貝數與多重ddPCR擴增拷貝數相近，可構建三重ddPCR反應體系。

圖2 金黃色葡萄球菌單重ddPCR檢測一維圖Fig. 2 One-dimensional diagram of single ddPCR detection of S. aureus

確定的最佳多重ddPCR反應體系為：PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix，5×5 μL，Fluorescein sodium salt（1 μmol/L）2.5 μL，10 μmol/L 引物上下游各 1 μL，探針 0.5 μL，模板 DNA 5 μL，dd H2O 補足25 μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，45個循環。多重ddPCR檢測結果見表3。已建立的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及沙門氏菌三重微滴式數字PCR的檢測方法可用于后續樣品的檢測。

表3 單重及多重微滴數字PCR檢測樣本拷貝數結果Table 3 Copy number of samples detected by single and multiple droplet digital PCR

2.3 多重ddPCR的特異性的確定

通過多重ddPCR證實3種目標菌均有相應陽性微滴，同時，設置了陰性菌株和空白作為對照，結果顯示均無擴增，說明引物、探針的特異性較好，即非目標菌均無特異性擴增，3組引物探針具有良好的特異性，且不會產生交叉反應，多重dPCR特異性擴增結果見圖4。

圖4 三重ddPCR特異性檢測一維圖Fig. 4 One-dimensional map of specificity detected by triple ddPCR

2.4 三重ddPCR靈敏度的確定

將3種致病菌的基因組DNA混合后，進行10梯度稀釋、6個梯度樣本和3次技術重復，以檢測反應體系的靈敏度。微滴式數字PCR拷貝數濃度檢測結果如表4。由表4可知，三重微滴式數字PCR檢測3種致病菌的絕對定量檢測低限分別為腸炎沙門氏菌0.68 copies/μL，RSD為41.29%；金黃色葡萄球菌0.79 copies/μL，RSD為39.60%；大腸埃希氏菌1.02 copies/μL，RSD為25.26%。三重微滴數字PCR結果一維圖見圖5。

圖5 三重ddPCR靈敏度檢測一維圖Fig. 5 One-dimensional map of sensitivity detected by triple ddPCR

1）·μLCp E.coli/（菌氏希埃CR 腸大igital P果結測roplet d檢度敏μL-1）R靈重detection results b y triple d s/（C p·PC字數S. aureu滴 菌微 球萄4 三葡色黃表en sitivity金ble 4 S Ta μL-1）S. enteritidis /（C p·菌氏門沙炎腸釋稀本樣RSD/%SD G AV Repeat3 Repeat2 Repeat1 RSD/%SD VG Repeat3A epeat2 Repeat1R D/%RS SD VG Repeat3A epeat2 Repeat1R Sample dilution 5.37 6.04 43 3 8 117.3 8 460 02 7 5 90 8 3 4.16 8 044.33334.64 55 8 2 7 572 06 8 3 7240.892.95 8 154.6 8 326 7 814 8 324 A-10×DN 3.93.33 31 796.53 803.1 755.3 831.2 2.99 6.8 23 7.93 79 788.1 774.9 830.8 4.57 2 34.2 8.33 74 756.9 2.8 70 785.3 A-100×DN 5.88 4.58 77.87 76.6 73 84 9.78 7.92.97 80 69.8.8 85 87.3 9.84 7.33 74.47 83.8.9 65 73.7 A-1 000×DN 17.31 1.33 7.66 5.8 8.78 8.41.76 12 0.97 7.57 8.38 8.11 6.21 15.15 1.06 6.97 5.48 7.77 7.67 0×A-1000 DN 6 25.2 0.26 1.02 1.32 0.69 1.06 39.60 0.31 1.02 0.99 1.04 0.35 41.29 0.28 0.68 0.66 1.04 0.35×00 A-100 0 DN 1.42 14 0.82 0.58 0 1.75 0/0 0 0 0 0/0 0 0 0 0 A-1 000 000×DN

以反應體系中 DNA 模板稀釋倍數為橫坐標，以3個平行檢測拷貝數結果為縱坐標繪制線性范圍擬合曲線，如圖6所示，腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的拷貝

圖6 三重ddPCR靈敏度檢測線性范圍擬合曲線Fig. 6 Fitting curve of linear range for triple ddPCR sensitivity detection

數的對數值均與 DNA 模板稀釋倍數的負對數值呈現高度的線性相關，相關系數達到0.99以上。說明本實驗建立的微滴式數字PCR法具有良好的定量線性相關性，適用于腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的拷貝數濃度定量檢測。

2.5 畜禽養殖廢棄物中三種致病菌的檢測結果

使用糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱法）提取16份樣本（每份樣品3 g）。提取后檢測DNA濃度，檢測結果見表5，瓊脂糖凝膠電泳操作及結果見表6、圖7。

圖7 16份樣本瓊脂糖凝膠電泳結果Fig. 7 Agarose gel electrophoresis results of 16 samples

表5 16份樣本DNA濃度檢測結果Table 5 DNA concentration test results of 16 samples

表6 16份樣本DNA濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測表Table 6 Detection of DNA concentration in 16 samples by agarose gel electrophoresis

將上述樣本DNA樣本進行三重ddPCR檢測，確認樣本中是否含有相關致病菌。三重ddPCR一維圖結果如圖8，檢測結果如表7。

表7 16份樣本三重微滴數字PCR拷貝數檢測結果Table 7 Copy number detection results for 16 samples by triple droplet digital PCR

圖8 三重ddPCR檢測14樣本一維圖Fig. 8 One-dimensional diagram of detecting 14 samples by triple ddPCR

檢測結果表明，在16個樣本中，僅雞6檢出腸炎沙門氏菌；僅豬4檢測到金黃色葡萄球菌；豬1、豬4、豬5、豬7、雞4、雞6和雞7中都檢測到大腸埃希氏菌。

3 討論

在我們現場實地取樣調查中發現，各個取樣點的樣品均有不同程度的畜禽養殖糞污的典型致病菌污染。這也反映了我國目前即使在同一地區的不同區域內，也存在著畜禽養殖無害化處理技術的參差不齊且整體水平有待提升的現狀。

國內外對于3種典型致病菌的檢測方法進行了大量的研究和對比。國標法使用傳統培養的方式檢測典型致病菌，通過前增菌、選擇性增菌、目的菌株分離、生化試驗、革蘭氏染色和血清學鑒定等環節對病原菌進行鑒定計數［3］。但此方法的整個流程約耗費一周時間，且實驗中多種培養基的配制、復雜的操作流程，使之對待測樣品不能及時準確快速地檢測出結果。Malorny 等［21］建立了檢測肉和蛋中沙門氏菌的qPCR技術，Kawasaki 等［22］建立了檢測沙門氏菌、單增李斯特氏菌和大腸埃希氏菌的三重qPCR方法，其自動化程度高，最快檢測周期只需6 h，相較于傳統培養法極大地提高了對病原菌的檢測效率和準確度［23］。ddPCR技術則在此基礎上實現了對3種典型致病菌的絕對定量測定，相較三重qPCR法具有更高的靈敏度和準確度的技術優勢。

對于多重ddPCR技術，尚存幾個亟待解決的問題。ddPCR技術運用需依靠實驗室條件下的微滴式數字PCR檢測系統，目前檢測花費較高且尚未開發出現場實時檢測設備，這成為該方法廣泛推廣的障礙性因素。ddPCR技術基于傳統PCR原理，因此假陽性、假陰性的現象不可避免。較好的檢測效果應是其線性、非散點式微滴縱向分布于陽性與陰性微滴的交接處，此次試驗就有較好的效果呈現，但今后仍需應注意諸多試驗方面的控制。例如，實測樣品盡可能好地進行樣品前處理，提取核酸前對待測菌進行有效的富集，避免其他成分因素的干擾；根據目標生物的不同核酸特性，應及時調整引物、模板、dNTP、Mg2+、緩沖液、DNA聚合酶的濃度，優化反應體系和反應條件，減少非特異性擴增；當多種引物同時存在時，可適當地對引物進行前處理或通過提高退火溫度、延長退火時間以及添加5%的二甲基亞砜或甘油等輔助劑來盡可能地減少引物二聚體的形成，保持體系較好的擴增效率和檢測特異性；同時，整個實驗檢測環境應保持較好的負壓條件，減少人為操作引起的核酸氣溶膠污染。對于典型致病菌更好的三重ddPCR反應體系的配比選擇和反應系統的參數設置今后仍需繼續優化。

4 結論

本研究建立了畜禽養殖糞污中3種典型致病菌的多重微滴數式數字PCR反應體系，確定了以FAM、HEX和CY5 的TaqMan探針熒光基團，以10 μmol/L引物上下游各1 μL，探針0.5 μL，模板DNA 5 μL，3組引物探針的退火溫度均為60℃的25 μL定量反應體系。在該反應體系中，檢測腸炎沙門氏菌的絕對定量檢測低限為0.68 copies/μL；檢測金黃色葡萄球菌的絕對定量檢測低限為0.79 copies/μL；檢測大腸埃希氏菌的絕對定量檢測低限為1.02 copies/μL。