慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個核細胞中S100A10表達及意義

宋亞茹，李榮凱，翟成凱，韓 飛，婁運偉，王 輝

(1.新鄉醫學院附屬人民醫院呼吸與危重癥醫學科二病區，河南 新鄉 453000；2.新鄉醫學院醫學檢驗學院，河南 新鄉 453003；3.河南省免疫與靶向藥物重點實驗室，河南 新鄉 453003)

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是指肺功能持續性下降的慢性呼吸系統疾病，其發病機制復雜，與環境因素、遺傳因素密切相關。免疫和炎癥介質在COPD致病過程中發揮重要作用[1-2]，如外周血中白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等細胞因子水平和淋巴細胞亞群水平與COPD病情的嚴重程度密切相關[3-4]。S100蛋白是一類多功能的小分子Ca2+結合蛋白家族，S100A10是該蛋白家族的一個成員，S100A10缺乏EF-hand Ca2+結合結構域[5-7]。S100A10是由2個相對分子質量為11 000的亞單位組成的二聚體，屬于胞內蛋白，當其與配體Annexin A2結合后，以(S100A10)2-(Annexin A2)2四聚體的形式存在于細胞膜上，是纖溶酶原的受體[7-8]。已有研究表明，S100A10在多種炎癥相關疾病患者如抗磷脂綜合征、系統性紅斑狼瘡和多種腫瘤組織中呈異常表達[9-11]。S100A10通過調節纖維蛋白酶的產生和基質金屬蛋白酶9的活性調節巨噬細胞和中性粒細胞向炎癥部位的遷移，S100A10還可通過影響腫瘤相關巨噬細胞向腫瘤組織的浸潤來參與腫瘤的進程[12-13]。最近研究發現，S100A10在Toll樣受體信號轉導和抗感染免疫過程中發揮重要作用，如S100A10基因缺陷的巨噬細胞過度活化，分泌更多的TNF-α、IL-6、IL-12和 干擾素-β等細胞因子，提示在免疫應答過程中S100A10可抑制多種促炎細胞因子的產生[14]。但S100A10在COPD患者中的表達變化未見報道，S100A10在COPD進程發揮的作用仍不清楚。基于此，本研究通過比較健康對照者和COPD患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中S100A10的表達變化，分析其表達水平與肺功能相關指標的相關性，探討S100A10在COPD疾病過程中的潛在作用，以期為S100A10在臨床COPD診療中的應用提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020年8月至2021年6月新鄉醫學院附屬人民醫院呼吸與危重癥醫學科收治的42例COPD患者為研究對象，其中男29例，女13例；年齡42～78(62.43±2.09)歲。病例納入標準：(1)符合中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組制定的COPD診斷標準[15]；(2)首次被診斷為COPD；(3)至少0.5 a內未服用過免疫調節劑和激素制劑；(4)意識清晰，主動配合；(5)患者同意加入本研究。排除標準：(1)有支氣管哮喘、間質性肺纖維化和肺癌等其他呼吸系統疾病史；(2)合并除呼吸系統疾病以外的其他臟器嚴重功能障礙者，如罹患嚴重心血管疾病、肝腎疾病和嚴重自身免疫性疾病的患者；(3)患有精神類疾病，存在交流障礙和認知障礙的患者。選擇同期在新鄉醫學院附屬人民醫院體檢中心體檢的健康志愿者31例為對照組，其中男20例，女11例；年齡37～76(61.51±1.78)歲。2組受試者的性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得新鄉醫學院附屬人民醫院倫理委員會審核批準(批準文號：2020072001)，受試者均知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 體質量指數(body mass index，BMI)、吸煙指數檢測患者入院后，應用醫用身高體重測量儀測量患者身高和體質量，并計算BMI[體質量(kg)/身高(m)2]；通過詢問病史，記錄患者的吸煙情況，并計算吸煙指數(每天吸煙支數×吸煙年數)。

1.2.2 肺功能測定2組受試者休息30 min后，應用RSF900肺功能檢測儀(德國耶格公司)檢測第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，FEV1)占預計值的百分比(FEV1%pred)和FEV1占用力肺活量(forced vital capacity,FVC)的百分比(FEV1/FVC)等肺功能指標。

1.2.3 血液采集及PBMC分離2組受試者均于清晨抽取空腹外周靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，在超凈臺中無菌操作下采用Ficoll密度梯度離心法分離獲取PBMC。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測PBMC中S100A10 mRNA表達取2組受試者PBMC，向PBMC中加入1 mL 細胞RNA提取液(RNAiso Plus，購自日本TaKaRa公司)裂解細胞。室溫靜置5 min，然后加入0.2 mL氯仿，震蕩15 s，室溫靜置3 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上層水相置于新EP管中，加入0.5 mL異丙醇，室溫放置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，加入1 mL 體積分數為75%的乙醇進行洗滌，渦旋混合，4 ℃12 000 r·min-1離心5 min，棄上清，然后加入50 μL無RNA酶的去離子水溶解RNA沉淀。用分光光度計測定RNA濃度，應用RT Master mix反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)將細胞總RNA反轉錄成cDNA。以反轉錄的cDNA為模板，以β-actin為內參使用TB Green Premix Ex Taq II試劑盒(日本TaKaRa公司)進行實時熒光定量PCR。引物序列(由蘇州金唯智生物科技有限公司合成)：S100A10正義鏈為5′-CCAGGTTTCGACAGACTCTTC-3′，反義鏈為5′-CCGTTCCATGAGCACTCTC-3′，擴增長度為135 bp；內參β-actin 正義鏈為5′-GGAAATCGTGCGTGACATTAA-3′，反義鏈為5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3′，擴增長度189 bp。反應程序為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。每份標本的S100A10和內參均做3個復孔，復孔之間的Ct值誤差控制在0.5以內，采用2-ΔΔCt法計算S100A10基因的相對表達量。

1.2.5 Western blot法檢測PBMC中S100A10蛋白表達取2組受試者的PBMC，每份樣品中加入100 μL放射免疫沉淀( radio-immunoprecipitation，RIPA) 蛋白裂解液(上海碧云天生物技術公司)和蛋白酶抑制劑的混合液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min后取上清液，采用二喹啉甲酸法測定上清液蛋白濃度(二喹啉甲酸檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司)。在剩余樣品中加入適量體積的5×蛋白 loading buffer，100 ℃加熱10 min，將這些蛋白樣品保存在-20 ℃冰箱。取15 μg 蛋白樣品進行十二烷基硫 酸 鈉 聚 丙 烯 酰 胺凝膠電泳后轉移到聚偏二氟乙烯膜上，加入體積分數5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入S100A10抗體(滴度11 000)和β-actin 抗體(滴度11 000)，4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加入相應種屬的HRP標記的二抗(滴度15 000)，室溫孵育 1 h，然后滴加電化學發光液染色，應用Amersham Imager 600RGB儀器曝光顯色并進行圖像采集，使用Image J圖像分析軟件分析條帶的灰度值，目的蛋白的相對表達量以目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值表示。

1.2.6 流式細胞術檢測PBMC細胞亞群中S100A10的表達將收集的健康對照組和COPD組的PBMC保存在液氮中，進行流式細胞術分析時，把凍存的PBMC快速解凍復蘇后用固定打孔試劑盒(Fixation/Permeabilization Solution Kit，購自美國BD公司)進行固定打孔。PBMC中S100A10應用小鼠抗人單克隆抗體(滴度1100，購自美國BD公司)進行染色，同型對照應用小鼠IgG單克隆抗體(滴度1100，購自美國Biolegend公司)進行染色；然后，用別藻藍蛋白熒光標記的兔抗小鼠的二抗(美國Thermo Fisher Scientific公司)識別一抗。細胞充分洗滌后，用含體積分數1%小鼠血清和體積分數1%胎牛血清的封閉液封閉，然后用抗體CD4(滴度1200)、CD8(滴度1100)、CD14(滴度1200)和CD19(滴度1200)混合液染色30 min，充分洗滌后，用FACSCanto流式細胞儀(美國BD公司)檢測，通過前向角散射(forward scatter,FSC)-A和側向角散射(side scatter,SSC)-A排除細胞鎖片，通過FSC-A和FSC-H排除粘連的細胞，接著分別圈出CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD14+單核細胞和CD19+B淋巴細胞，再分析各亞群中的S100A10平均熒光強度，S100A10蛋白的相對表達量以各個亞群中S100A10平均熒光強度表示。

2 結果

2.1 2組受試者的體質量指數(body mass index，BMI)、吸煙指數及肺功能指標FEV1%pred、FEV1/FVC比較結果見表1。COPD組患者的BMI、FEV1%pred、FEV1/FVC顯著低于健康對照組，吸煙指數顯著高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 2組受試者BMI、吸煙指數及肺功能指標FEV1%pred、FEV1/FVC比較

2.2 2組受試者PBMC中S100A10 mRNA和蛋白相對表達量比較結果見表2和圖1。COPD組患者PBMC中S100A10 mRNA和蛋白相對表達量顯著低于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 2組受試者的PBMC中S100A10 mRNA和蛋白相對表達量比較

2.3 2組受試者PBMC不同細胞亞群中S100A10蛋白相對表達量比較結果見表3。COPD組患者的CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD19+B淋巴細胞中S100A10蛋白相對表達量與健康對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；COPD組患者的CD14+單核細胞中S100A10蛋白相對表達量顯著低于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 2組受試者的PBMC不同淋巴細胞亞群中S100A10蛋白相對表達量比較

2.4 COPD患者PBMC中S100A10 mRNA表達水平與FEV1%pred的相關性分析結果見圖2。COPD患者PBMC中S100A10 mRNA表達水平與FEV1%pred呈負相關(r=-0.610，P<0.05)。

3 討論

COPD是慢性氣道炎癥性疾病，氣流受限呈現進行性發展，與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒產生異常炎癥反應密切相關。在COPD疾病早期即可見促炎癥細胞如中性粒細胞和單核/巨噬細胞的浸潤和多種促炎癥介質的釋放，隨著疾病的進展可導致肺間質細胞不斷增生，從而破壞局部肺組織的正常結構，出現肺功能受損和組織重構。本研究結果顯示，COPD組患者的吸煙指數顯著高于對照組，BMI、FEV1%pred、FEV1/FVC顯著低于健康對照組，提示COPD與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒產生異常炎癥反應相關，COPD患者存在一定程度的肺組織重構和肺功能受損。因此，如何有效阻止或逆轉肺組織重構和肺功能受損這一過程是預防和治療COPD的關鍵[1,16-17]。

目前認為，S100A10是一種抗炎蛋白，一方面參與調節血纖維蛋白溶酶原依賴的單核/巨噬細胞和中性粒細胞向炎癥部位的遷移及浸潤，另一方面還直接控制這些免疫細胞的活化狀態以避免過度活化造成免疫病理損傷。因此，S100A10可通過抑制固有免疫應答及隨后的適應性免疫應答參與多種炎癥性疾病的發病和進展。有研究報道，與健康對照者和無自殺傾向的精神疾病患者相比，有自殺傾向的精神疾病患者外周血PBMC中S100A10的表達水平顯著下降，認為PBMC中S100A10的表達水平可作為評估自殺風險的潛在的生物標志物[18]。GREEN等[19]研究報道，帕金森病患者PBMC中S100A10的表達水平顯著降低，單核細胞、自然殺傷細胞和CD8+毒性T淋巴細胞中S100A10的表達水平與帕金森病的嚴重程度呈正相關，自然殺傷細胞中S100A10的表達水平與抑郁評分亦呈正相關的關系。以上這些研究結果提示，循環外周血中免疫細胞上的S100A10表達水平與帕金森病的進程和抑郁的程度存在關聯。但是S100A10在COPD患者中的表達變化及是否參與COPD疾病進程尚不明確。

本研究結果顯示，COPD組患者的PBMC中S100A10 mRNA和蛋白相對表達量顯著低于健康對照組，且COPD組患者的CD14+單核細胞中S100A10蛋白相對表達量顯著低于健康對照組，而CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD19+B淋巴細胞中S100A10蛋白相對表達量與健康對照組比較無顯著差異，這一結果提示，S100A10可能是選擇性地通過影響單核細胞的功能參與COPD進程。COPD發病過程中在多種刺激因素的作用下，如急性加重期常伴有流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌等多種細菌感染，可使COPD患者的免疫系統被異常活化，從而誘導單核/巨噬細胞活化，釋放大量TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎介質，CD4+效應性T淋巴細胞活化分泌IL-17和IL-23等細胞因子，這些促炎介質和細胞因子作用于PBMC，進而抑制S100A10的表達。有研究報道，COPD患者中CD45+CD11b+F4/80+巨噬細胞和CD4+T淋巴細胞和Th17細胞數量和比例增加，而調節性T細胞的數量和比例減少[20-22]。S100A10作為一種重要的抗炎蛋白，其表達被抑制可能意味著其抑制炎癥反應的能力被削弱。本研究通過分析S100A10 mRNA表達水平與肺功能指標FEV1%pred的相關性發現，COPD患者PBMC中S100A10 mRNA表達水平與肺功能指標FEV1%pred存在明顯的負相關，證實S100A10 mRNA表達在COPD發病過程中具有重要作用。

綜上所述，COPD患者PBMC中S100A10呈異常表達，可選擇性地通過影響單核細胞的功能參與COPD進程，但其細胞和分子機制以及能否作為生物標志物用于臨床診斷COPD和成為潛在治療靶點有待于進一步深入的研究。