919糖漿對非酒精性脂肪肝大鼠肝功能保護效應及其機制研究

潘丹青，徐月妹

(1.上海中醫藥大學，上海 201203；2.復旦大學附屬金山醫院中醫內科，上海 201508)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFLD) 指除酒精和其他明確損肝因素外所致的以肝細胞脂肪沉積過度及脂肪變性為主要特征的臨床綜合征[1]。近年來，隨著人們飲食結構和生活方式的變化，非酒精性脂肪肝的發病率持續遞增，且患病人群逐漸年輕化，已成為人類最常見的慢性肝臟疾病之一[2]。常規西藥干預為NAFLD的主要治療方法，可改善患者肝功能、血脂水平等，但長時間應用易誘發諸多副作用或不良反應，具有一定的局限性。中醫認為非酒精性脂肪肝屬于“痰濁”“肝癖”“脅痛”“血瘀”范疇，所以中醫治療非酒精性脂肪肝患者一般主張化痰、祛濕、活血、疏肝[3]。919糖漿是一個中藥復方制劑，由獼猴桃、太子參、茯苓、白術、陳皮、白豆蔻、淫羊藿、丹參、柴胡等藥組成，集調理陰陽、理氣活血、健脾化濕、清熱解毒、滋養肝腎等法于一爐。既往研究[4-5]證實該方安全有效，具有保肝降酶、抗肝纖維化的作用。本研究擬通過復制NAFLD動物模型，觀察919糖漿對NAFLD大鼠的肝功能及其肝組織形態的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，SPF級，雄性，體重(170±10) g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證編號：SYXK(滬)2015-0008。動物飼養于上海市公共衛生臨床中心實驗動物部。室溫20～26 ℃、相對濕度40%～70%，12 h避光，12 h光照，自由飲食。所有實驗大鼠的使用和喂養嚴格遵照動物保護協會所規定的有關條款。

1.2 動物飼料及實驗藥品

高脂飼料配方：88%普通飼料，2%膽固醇，10%豬油。由北京博愛港生物技術有限公司生產，貨號：BAG1001。

919糖漿委托山東廣育堂國藥有限公司生產，產品代號TJ004,生產批號：20181201。

組成：獼猴桃汁20 g，太子參5 g，丹參10 g，柴胡2 g，白術5 g，陳皮2.5 g，淫羊藿4g，白豆蔻1.5 g。制法：蒸餾水45 mL煮沸，加蔗糖溶解，加熱至100 ℃，趁熱保溫過濾，自濾器加熱蒸餾水100 mL即得。

1.3 主要儀器與試劑

DNM-9602酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)，A-1506P紫外分光光度計(上海譜元儀器有限公司)，正置顯微鏡(日本NIKON公司)，移液器(美國吉爾森P型移液器公司)，恒溫烘箱(上海恒一科學儀器有限公司)，冰凍切片機(湖北徠克公司)，攤片機(湖北徠克公司)，水浴鍋[Leica(萊卡公司)]，顯微圖象分析系統(日本NIKON公司)，成像系統(Tanon公司)，甲醛(10010018)、異丙醇(40064360)購自上海國藥集團，油紅O(S19039，上海源葉生物科技有限公司)，甘油明膠(IH0270，北京雷根生物技術有限公司)，甘油三酯試劑盒(A110-2)，總膽固醇試劑盒(A111-1)，谷草轉氨酶試劑盒(C0010-2)，谷丙轉氨酶試劑盒(C009-2)，微量丙二醛試劑盒(A003-2)，超氧化物歧化酶試劑盒(A001-1)均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 方法

1.4.1 實驗動物分組與給藥 造模及分組：隨機選取9只雄性SD大鼠作為正常組，予以普通飼料喂養；25只雄性SD大鼠作為造模組，予以高脂飼料喂養，連續喂養14周，復制NAFLD模型。在14周末，分別從正常組和造模組隨機選取1只大鼠處死，對肝臟組織進行油紅O染色。光鏡下見到超過5%的脂肪變性的肝細胞即表明造模成功[6-7]。造模成功后使用SPSS22.0軟件，隨機將造模組大鼠分為模型組、高劑量組、低劑量組。正常組大鼠體重為(521.22±12.58) g；模型組大鼠體重為(522.56±13.86) g；919糖漿高劑量組大鼠體重為(523.37±14.33) g；919糖漿低劑量組大鼠體重為(525.45±13.48) g。各組大鼠體質量比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

藥物干預方法：正常組大鼠不進行藥物干預，模型組大鼠給予生理鹽水10 mL· kg-1· d-1進行灌胃給藥；高劑量組大鼠給予919糖漿27 g· kg-1·d-1進行灌胃給藥；低劑量組大鼠給予919糖漿6.75 g·kg-1·d-1進行灌胃給藥[4]。各組均干預8周。

1.4.2 樣本采集 干預8周后，各組通過相同的步驟采集各組大鼠的血液及肝臟標本：先將各組大鼠禁食12 h，在處死前稱重大鼠，用10%的水合氯醛進行麻醉，打開腹腔，經下腔靜脈采血，離心后取上清液。隨后快速地將肝臟分離出來，并用生理鹽水予以沖洗，再用濾紙去除上面的水分，最后給肝臟進行稱量，得到的數字就是肝濕重，肝濕重占動物體重的百分比即為肝指數。從肝臟右側最大葉取2×2 cm2大小的組織保存到-80 °C冰箱，待測MDA、SOD；再取2×2 cm2大小的肝臟組織，將組織置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，待HE染色用。

1.4.3 指標檢測 肝功能、脂代謝及氧化應激指標：取出血清后，嚴格按照試劑盒說明書操作，采用酶聯免疫吸附法測定血清中TG、TC、ALT、AST、SOD、MDA含量。

HE病理學檢測：取大鼠肝臟組織，采用10%福爾馬林固定，石蠟包埋后切片，二甲苯、乙醇依次脫蠟和水化。將入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色5 min，并在鹽酸及氨水中分色。流水沖洗1 h后置入蒸餾水中，將切片置于伊紅染色液染色2 min。切片蒸餾水洗滌后，經無水乙醇脫水，二甲苯透明后進行封片，中性樹脂固定后顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠體重、肝濕重、肝指數比較

與正常組比較，模型組大鼠肝濕重與肝指數上升(P<0.05)；與模型組比較，高劑量組和低劑量組肝濕重與肝指數降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質量及肝濕重、肝指數指標

2.2 各組大鼠肝功能及脂代謝指標比較

與正常組比較，模型組TG、TC、ALT、AST含量增加，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，低劑量組與高劑量組TG、TC、ALT及AST含量均下降，差異有統計學意義(P<0.01)。高、低劑量組相比，TG、TC、ALT及AST含量差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 干預后各組大鼠肝功能及脂代謝指標比較

2.3 各組大鼠肝組織MDA和SOD比較

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中MDA增加，SOD降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，低劑量組與高劑量組MDA值降低，SOD增加，差異有統計學意義(P<0.05)，高、低劑量組組間比較，MDA，SOD差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 干預后各組大鼠肝組織MDA、SOD比較

2.4 干預后各組大鼠形態學比較

干預8周后,各組大鼠肝臟HE染色顯示(200×)：正常組的大鼠的肝小葉結構表現正常，肝細胞大小形態正常、結構清楚完整，核圓清晰可見，少量肝細胞內可見細微空泡，肝竇顯示清晰，未見明顯炎細胞浸潤。與正常組相比，模型組肝細胞結構紊亂，肝小葉的結構比較模糊，肝細胞明顯腫脹，肝細胞內呈現大量大小各異的空泡沉積，肝竇消失，局灶可見少量炎細胞浸潤。與模型組相比，高劑量組與低劑量組肝細胞腫脹減輕，肝細胞內空泡數量減少、空泡形狀縮小，高劑量組較低劑量組改善更為明顯。見圖1。

3 討論

NAFLD是一種與肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病、高血壓、高脂血癥和代謝綜合征相關的肝病，給患者、其家人和社會帶來嚴重的健康、經濟和體驗負擔[8]，由于糖尿病和肥胖癥的流行，NAFLD 的患病率在中國迅速增加[9-10]。中醫藥在治療非酒精性脂肪肝各個方面均有著突出的優勢，追溯古代文獻中對非酒精性脂肪肝的臨床特點、病因病機等描述，將其歸納為肥氣、痰濁、脅痛、積聚、肝癖等范疇[11]。病因以濕盛為主，病機以脾虛為首，總的來說，非酒精性脂肪肝多因飲食不節、起居失常、情志不調、久病體虛，引起肝失疏泄、脾失健運、痰濕內阻、氣機不利、瘀血阻滯等導致肝脾腎三臟功能失調而致[12]。919糖漿是一種中藥復方制劑，由獼猴桃、太子參、茯苓、白術、陳皮、白蔻、淫羊藿、丹參、柴胡組成。具有燮理陰陽、理氣活血、健脾化濕、清熱解毒、滋養肝腎等功效。在臨床可以用于肝損傷的肝細胞保護。

本研究利用高脂飲食成功復制大鼠非酒精性脂肪肝模型，模型組大鼠與正常大鼠比較，肝功能及脂代謝指標出現異常，光鏡下肝組織形態出現大量大小各異的空泡沉積，肝竇消失，局部炎細胞浸潤，呈現脂肪肝及肝損傷的特點。通過給予919糖漿灌胃干預，研究結果表明，無論劑量高低，用藥組大鼠肝功能指標ALT、AST及脂代謝相關指標TG、TC與模型組比較，含量水平降低，光鏡下肝組織形態分析也顯示：藥物組比模型組，肝細胞腫脹減輕，肝細胞內空泡數量減少、空泡形狀縮小，結果提示，919糖漿可以有效改善NAFLD大鼠肝功能，糾正大鼠脂代謝異常狀態，對肝損傷形成保護效應，且該效應呈現劑量依賴特點，即高劑量組效應比低劑量效應更優。進一步通過檢測氧化應激的相關指標SOD、MDA，結果發現，模型組大鼠SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增多，提示NAFLD與氧化應激相關，藥物干預后，大鼠肝組織SOD含量升高，MDA含量降低，提示藥物效應與改善大鼠氧化應激水平有關。本研究是對于919糖漿治療性給藥對脂肪肝大鼠保護作用的初步探討，與同類研究[13-16]相比較，我們將目光聚焦于氧化應激和增強抗氧化防御治療NAFLD的機制。但對于其更深層次的分子機制尚未充分揭示，這也將是今后研究的一個重要方向。

綜上，919糖漿可通過減少NAFLD大鼠肝組織中的活性氧含量，增強抗氧化防御水平，減少氧化應激損傷來實現對于NAFLD大鼠肝組織的保護效應，且該效應成劑量依賴的特點。