含Sushi重復蛋白X連鎖2基因敲除對肺腺癌A549細胞生物學特性的影響

趙 雋，溫 松，于法明，姜東亮，李慎柯

(1.新鄉醫學院，河南 新鄉 453003；2.濮陽市油田總醫院呼吸科，河南 濮陽 457001)

據統計，在世界范圍內，肺癌是癌癥所致死亡的首要原因[1]。肺腺癌是非小細胞肺癌的一種，占肺癌患者總數的40%左右[2]。含Sushi重復蛋白X連鎖2(Sushi repeat containing protein,X-linked 2,SRPX2)是一種新型的硫酸軟骨素蛋白聚糖，可影響細胞的遷移、黏附等生物學行為，并具有促血管生成作用[3]。 SRPX2最早在白血病細胞中被發現[4]，在食管癌、胃癌、肝癌、子宮內膜腺癌、結腸癌等多腫瘤細胞中均存在過度表達[5-9]。有研究表明，SRPX2與腫瘤細胞的侵襲和遷移密切相關[10]。但SRPX2在肺腺癌細胞中的生物學特性和功能尚不清楚?；诖?，本研究采用成簇規律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)-CRISPR 相關蛋白9(CRISPR associated protein 9，Cas9)基因編輯技術敲除肺腺癌人類肺泡基底上皮細胞A549細胞中的SRPX2基因，觀察SRPX2基因對肺腺癌細胞生物學特性的影響，以期為開發肺腺癌新的有效的治療靶點或預后標志物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器野生型肺腺癌人類肺泡基底上皮細胞系A549細胞、快速核酸釋放試劑、CRISPR-U敲除質粒購自廣州源井生物科技有限公司，胎牛血清、達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbeco′s modified Eagle′s medium，DMEM)、NeonTM轉染系統試劑盒(重懸緩沖液 R、重懸緩沖液E2)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，嘌呤霉素購自美國Invivogen公司，細胞周期檢測試劑盒、細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購自上海碧云天生物技術有限公司，DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；臺式冷凍離心機、CO2恒溫培養箱、移液器、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀、電轉儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司，流式細胞儀購自日本NIKON公司，酶標儀購自美國BioTek公司，電泳儀購自北京六一儀器公司。CRISPR-UTM表達質粒[含小向導RNA(small guide RNA,sgRNA)、Cas9、增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)基因熒光標簽及抗嘌呤霉素基因]、本研究所用引物的合成由廣州源井生物科技有限公司完成。

1.2 細胞培養與分組將A549細胞培養于含體積分數10%胎牛血清、100 mU·L-1鏈霉素和100 mU·L-1青霉素的DMEM中，置于37 ℃、含體積分數5% CO2的細胞培養箱中培養。根據是否敲除SRPX2基因將A549細胞分為對照組和敲除組，敲除組細胞采用CRISPR-Cas9方法敲除SRPX2基因，對照組細胞常規傳代培養。

1.3 SRPX2基因敲除肺腺癌細胞系構建

1.3.1 CRISPR-Cas9法敲除A549細胞SRPX2基因將對數生長期的A549細胞制成單細胞懸液，細胞計數后取3×106個細胞置于無菌管中，300×g離心4 min，棄上清，取600 μL重懸緩沖液R重懸細胞沉淀，然后加入30 μg無內毒素的CRISPR-UTM表達質粒混勻，備用。電擊杯中加入3 mL重懸緩沖液E2，使用100 μL電轉槍頭吸取A549細胞與CRPSPR-UTM表達質粒的混合物，插入電擊杯中電擊，以敲除部分SRPX2基因序列(5′-TAGTGGCACTTACACCTGCACAAATGGAGTGCTTCTTGACTCTCG-CTGTGACTACAGCTGTTCCAGTG-3′，長度為68 bp)。電轉完成后，將細胞接種于6孔板中繼續培養。轉染24 h后，顯微鏡下觀察電轉效果，選擇細胞存活率較高及表達綠色熒光蛋白細胞相對較多的孔，更換為含有終質量濃度1 mg·L-1嘌呤霉素的完全DMEM篩選并培養72 h。

1.3.2 篩選SRPX2基因敲除單克隆細胞并驗證使用有限稀釋法將對照組和敲除組A549細胞分別稀釋并接種至96孔板，每孔100個細胞，置于37 ℃、含體積分數5% CO2細胞培養箱中靜置培養，培養1周后觀察細胞克隆的生長情況，標記含有單克隆細胞簇的孔。當標記的單克隆細胞匯合度達到40%～60%時，將96孔板內的培養基傾倒干凈，加入100 μL快速核酸釋放試劑，室溫靜置10 min，1 000×g離心5 min，取上清(細胞核酸)。分別使用引物F1/R1(擴增SRPX2基因829 bp)和引物F1/R2(擴增SRPX2基因至部分敲除序列355 bp)對敲除組和對照組細胞核酸進行PCR擴增，PCR反應體系： DNA模板1 μL，2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL雙蒸水22 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性 3 min，95 ℃變性15 s，95 ℃退火15 s，72 ℃延伸50 s，30個循環；72 ℃終延伸5 min。SRPX2基因引物序列如下：F1:5′-AATGTACAGTGTTAGGTCTGATTTTG-3′；R1:5′-GGGTCCCAGTATACTCGAGC-3′，R2:5′-GTCACAGC-GAGAGTCAAGAAG-3′。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下呈像得到電泳圖譜。將目的條帶進行膠回收，并測序。根據PCR產物電泳圖譜及測序結果，將成功敲除SRPX2基因的陽性克隆A549細胞繼續傳代培養并于液氮中凍存，獲得SRPX2基因敲除的A549肺腺癌細胞系(敲除組)。由廣州源井生物科技有限公司完成對PCR擴增產物的DNA測序工作。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期取敲除組及對照組生長狀態良好的對數生長期細胞，以每孔約5×104個細胞分別接種于2個6孔細胞板中，每組設置3個復孔。2個6孔細胞板分別培養24、48 h時，用胰蛋白酶消化細胞，1 000×g離心 5 min，棄上清；加入約1 mL預冷的磷酸鹽緩沖溶液洗滌，重懸細胞，轉移到1.5 mL離心管中，1 000×g離心5 min，棄上清。加入1 mL預冷的體積分數70%乙醇，輕輕吹打混勻；置于4 ℃冰箱中固定12 h；1 000×g離心5 min沉淀細胞；再用預冷的磷酸鹽緩沖溶液洗滌，1 000×g離心 5 min，棄上清。加入0.5 mL細胞周期檢測試劑盒中的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀。37 ℃避光溫浴30 min，使用流式細胞儀和FlowJo軟件檢測細胞周期分布情況。實驗重復3次，取均值。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖情況取敲除組及對照組對數生長期細胞，細胞融合率達到80%～90%時，用胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖溶液重懸細胞，300×g離心3 min，用細胞計數板進行細胞計數后調整細胞密度為4×107L-1，接種于5個96孔板中，每孔100 μL，分別于培養0、24、48、72、96 h時，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于細胞培養箱中孵育2 h，使用酶標儀檢測波長450 nm處吸光度值。吸光度值越高表示細胞增殖能力越強。實驗重復3次，取均值。

1.6 Transwell小室實驗檢測細胞遷移能力取敲除組及對照組對數生長期細胞，棄上清后使用磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次，胰蛋白酶消化細胞，300×g離心3 min，棄上清，使用培養基重懸細胞并計數，調整細胞懸液為5×108L-1，取100 μL上述細胞懸液滴加于2個Transwell板上室中，下室加入500 μL含體積分數15%胎牛血清的DMEM，分別于培養24、48 h后取出小室，吸棄培養基，用棉簽輕輕擦拭上室內的細胞。取新的24孔板加入40 g·L-1多聚甲醛600 μL，將上室放入，固定30 min；棄固定液，加入體積分數0.1%結晶紫600 μL染色10 min，使用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，棄去未與細胞結合的結晶紫，用棉簽輕輕擦拭小室的上側；適當風干后，于高倍顯微鏡下隨機選取5個視野拍照并計數遷移細胞數。實驗重復3次，取均值。

2 結果

2.1 SRPX2基因敲除鑒定結果結果見圖1。敲除組細胞成功敲除SRPX2基因68 bp序列。對照組細胞使用引物F1/R1、F1/R2擴增后的產物序列大小分別為829 bp、355 bp，敲除組細胞使用引物F1/R1、F1/R2擴增后的產物序列大小分別為761 bp、0 bp。

1：敲除組，引物F1/R1；2：對照組，引物F1/R1；3：敲除組，引物F1/R2；4：對照組，引物F1/R2；M：Marker。

2.2 2組肺腺癌細胞A549細胞周期分布比較結果見表1和圖2。培養24 h時，敲除組G0/G1及S期細胞所占比例顯著低于對照組，G2/M期細胞所占比例顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。培養48 h時，敲除組S期細胞所占比例顯著低于對照組，G2/M期細胞所占比例顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。培養48 h時，對照組與敲除組G0/G1期細胞所占比例比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 2組不同細胞周期細胞比較

圖 2 2組不同細胞周期細胞分布情況

2.3 2組肺腺癌A549細胞增殖能力的比較結果見表2。培養0、24、48、72、96 h時，2組細胞的增殖能力隨時間的延長均呈升高趨勢(P<0.05)。培養0、24、48、72、96 h時，2組細胞的增殖能力比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表2 2組A549細胞增殖能力比較

2.4 2組肺腺癌A549細胞遷移能力的比較結果見圖3。培養24 h時，對照組和敲除組的遷移細胞數分別為(24.200±3.899)、(6.800±1.304)個；培養48 h時，對照組和敲除組遷移細胞數分別為(92.200±6.419)、(48.800±2.280)個。培養24、48 h時，敲除組遷移細胞數顯著少于對照組，差異有統計學意義(t=9.464、14.247，P<0.05)。

圖3 2組A549細胞遷移情況(結晶紫染色，×40)

3 討論

肺癌是我國高發腫瘤之一，且病死率最高[2]。肺癌患者中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占80%左右[11]。近年來，雖然肺癌的診斷和治療取得了一定的進步，但半數以上的肺癌患者臨床診斷較晚，5 a生存率低于20%[3]。目前，雖然肺腺癌靶向治療取得一定的進步，但已進入了一個瓶頸期，關于新的治療靶點報道較少。因此，研究肺腺癌的發生、發展機制，尋找新的有效的生物靶標在肺腺癌的早期診斷、治療及預后評估中具有非常重要的作用。

SRPX2在不同惡性腫瘤組織中呈過表達，是食管癌、前列腺癌、肝細胞性肝癌、胰腺癌、結直腸癌以及胃癌的不良預后因素[12-15]。SRPX2可通過調控不同信號通路，參與腫瘤細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲等生物學過程[10，14,16-17]。TANG等[18]研究發現，SRPX2在人膠質母細胞瘤組織中的表達顯著上調，且SRPX2的過表達顯著誘導膠質母細胞瘤細胞的遷移和侵襲。此外，SRPX2對血管生成具有積極作用[19-20]。但目前尚無研究報道SRPX2在肺腺癌發生發展中的生物學作用。

本研究結果顯示，培養24 h時，敲除組G0/G1及S期細胞所占比例顯著低于對照組，G2/M期細胞所占比例顯著高于對照組；培養 48 h時，敲除組S期細胞所占比例顯著低于對照組，G2/M期細胞所占比例顯著高于對照組；培養48 h后，2組G0/G1期細胞所占比例比較差異無統計學意義；說明將A549細胞的SRPX2基因敲除對細胞周期進程產生影響，主要表現為S期細胞所占比例顯著下降，G2/M期細胞比例顯著增高，提示細胞周期被阻滯在G2/M期，從而抑制了細胞的增殖分裂， SRPX2可能通過調控A549細胞周期促進細胞分裂，這與SRPX2在食管癌細胞周期調控中的作用相似[21]。

HONG等[22]的研究表明，SPRX2基因敲除顯著抑制前列腺癌細胞的增殖。本研究結果顯示，2組細胞的增殖能力隨時間的延長均呈升高趨勢；培養0、24、48、72、96 h時，2組細胞的增殖能力比較差異均無統計學意義；這表明將A549細胞的SRPX2基因敲除不影響細胞的增殖能力，SRPX2在肺腺癌細胞增殖中未起到關鍵性作用。根據細胞周期實驗結果推測，SRPX2敲除可導致A549細胞增殖被抑制，但是，細胞增殖實驗結果顯示，SRPX2對A549細胞增殖無明顯影響；分析原因可能是細胞鋪板密度較高，影響細胞的增殖；或者是本研究的增殖實驗觀察時間較短，未觀測到細胞增殖的時間節點；也可能是細胞凋亡增多等原因共同導致的結果，后續仍需進一步研究證實。

此外，本研究結果顯示，敲除組遷移細胞數顯著少于對照組，說明將A549細胞的SRPX2基因敲除降低了A549細胞的遷移能力，提示SRPX2可能參與肺腺癌A549細胞的遷移過程，促進肺腺癌的臨床進展，可能與肺腺癌患者的預后不良相關。LIN等[23]研究發現，SRPX2可促進肝癌細胞的遷移和侵襲，而腫瘤細胞遷移到其他組織或器官會導致患者預后不良和存活率下降[24-25]。因此，SRPX2基因可能成為肺腺癌治療新的靶點。

綜上所述，敲除肺腺癌A549細胞中SRPX2基因可顯著抑制細胞的遷移、阻滯細胞周期，SRPX2基因可能成為肺腺癌治療的新靶點。本研究有助于為將來進一步探索和闡明SRPX2在肺腺癌發生發展中的作用以及其在肺腺癌的臨床診療和預后評估中的作用提供實驗依據。