轉化生長因子β調節子4對人肺鱗狀細胞癌類器官增殖、侵襲和轉移的影響

王安生，王祖義，鄭傳明，陳娜娜，李 偉，洪海寧,4 ，桑海威 ，王康武 ，李其才，陳力維，朱浩楠,5

(1．蚌埠醫學院第一附屬醫院胸外科，安徽 蚌埠 233004；2.蚌埠醫學院第一附屬醫院急診外科，安徽 蚌埠 233004；3.蚌埠醫學院第一附屬醫院呼吸病科，安徽 蚌埠 233004；4.蚌埠醫學院研究生院，安徽 蚌埠 233030；5.阜陽市人民醫院胸外科，安徽 阜陽 236012)

肺癌作為全球最常見的惡性腫瘤，其病死率一直位于腫瘤相關病死率的首位。據報道，2018年肺癌的發生率占全部惡性腫瘤的15%左右，肺癌的死亡比例占全部惡性腫瘤死亡病例的25%左右[1]。盡管靶向治療和免疫治療相關的新藥研發提高了肺癌的總體生存期(overall survival,OS)，但2012～2015年中國的肺癌患者5 a存活率仍僅為19.7%，其中農村地區患者5 a生存率僅為15.4%[2]，而預計肺癌仍會是未來10年病死率最高的腫瘤之一。有研究報道，肺癌的發生是由眾多基因的突變引起的，包括上皮生長因子細胞增殖和信號傳導的受體基因、鼠類肉瘤病毒癌基因、p53和磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)基因等基因，但肺癌發生的具體機制尚不完全清楚，值得深入探討[3]。

原始干細胞或成體干細胞在體外3D環境下培養形成類器官模型，是最近新興起來的體外模型，其在結構和功能上與成體組織高度接近[4]。類器官模型彌補了細胞系和小鼠品系等傳統模型存在細胞系細胞類型單一和某些小鼠品系胚胎容易致死等問題[5]。肺癌類器官是收集患者手術切除的癌組織，然后進行消化分離出腫瘤細胞，緊接著進行3D細胞培養，使得腫瘤細胞形成“微器官”。與傳統的腫瘤細胞系相比，該模型的優點是具有更高的臨床相關性和個體多樣性。

轉化生長因子β調節子4(transforming growth factor β regulator 4，TBRG4)是編碼轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的調節子。近年來越來越多的研究發現，TBRG4的異常高表達與腫瘤的發生、發展密切相關[6]，但其在肺癌中的作用尚未闡明。因此，本研究采用沉默TBRG4的慢病毒轉染人肺鱗狀細胞癌類器官觀察TBRG4是否通過PTEN/磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號通路調節人肺鱗狀細胞癌類器官增殖、侵襲和遷移等生物學行為，為初步探討TBRG4基因作為治療肺鱗狀細胞癌的可能潛在靶點提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器TBRG4沉默慢病毒購自漢恒生物科技(上海)有限公司,細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購自上海貝博生物有限公司,小鼠抗β-actin抗體、兔抗增殖細胞核抗體(proliferating cell nuclear antibody,PCNA)、兔抗PTEN抗體、兔抗磷酸化PI3K (phosphorylated PI3K，p-PI3K)抗體以及兔抗磷酸化AKT(phosphorylated PI3K，p-AKT)抗體均購自英國Abcam公司，所有抗體稀釋比例均為11 000；雙面超凈操作臺購自蘇州凈化設備有限公司,冷凍離心機購自德國Beckman公司；光學顯微鏡購自重慶光電儀器廠,電熱恒溫水浴鍋購自北京醫療設備廠,低速大容量離心機購自上海安亭科學儀器廠,小型固定轉速離心機購自美國SCILOGEX公司,立式壓力蒸汽滅菌器購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠,電熱鼓風干燥箱購自上海市實驗儀器總廠,Millipore實驗室純水機購自美國Pall公司,-80 ℃超低溫冰箱購自日本三洋公司,CO2細胞培養箱、酶標儀購自美國Thermo Scientific公司,恒溫多功能振蕩器購自美國HRYSTAL公司,旋渦混合器購自邯鄲天儀電子儀表有限公司,電子分析天平購自上海精科天平廠,移液器購自法國PIPETMAN公司,PowerPac TM Basic電泳儀電源、垂直電泳槽購自美國Bio-Rad公司,化學發光成像系統購自北京天倫生物科技有限公司。

1.2 Western blot法檢測人肺鱗狀細胞癌患者癌組織和癌旁組織中TBRG4蛋白表達收集2020年1月至2021年1月蚌埠醫學院第一附屬醫院手術切除的早期肺鱗狀細胞癌患者癌組織和癌旁組織(距病灶>5 cm以上的正常肺組織)，置于-80 ℃ 冰箱凍存以供后續研究使用。取1 g凍存的癌組織和癌旁組織加入1 mL裂解液[苯甲基磺酰氟/RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)]，使用前加入2 μL蛋白酶抑制劑與5 μL磷酸酶抑制劑Cocktail(2×)混合，用研磨器充分研磨組織，置于冰盒上，震搖裂解約15 min后，于4 ℃下14 000×g離心15 min，用移液器吸出上清液保存于新的離心管中，將其置入-80 ℃冰箱保存備用。緊接著用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，調整蛋白濃度。取30 μg等量蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析細胞蛋白后，進行常規濕法轉膜。用50 g·L-1脫脂牛奶在室溫條件下封閉膜 1 h，然后加入一抗稀釋液4 ℃ 孵育過夜。用含吐溫-20的 Tris緩沖鹽溶液(Tris-buffered saline and Tween-20，TBST)洗膜后，加入二抗稀釋液室溫孵育1 h。洗膜后進行化學發光顯色。以β-actin作為內參對照，應用Image J軟件對目的蛋白的表達進行量化。

1.3 人肺鱗狀細胞癌腫瘤細胞的分離及體外類器官培養將收集的癌組織標本冰上切割成直徑約4 mm的組織塊，用提前預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)沖洗干凈。然后用膠原酶消化組織1 h，用胰蛋白酶TrypLE Express在37 ℃條件下輕微振蕩消化10 min，最后形成的單細胞懸液既分離得到的腫瘤細胞。用細胞計數儀對單細胞懸液進行計數，調節細胞密度為1×107L-1，然后將細胞和基質膠均勻混合后重懸，最后按照每孔 50 μL 細胞接種于24孔板中形成基質膠凝固液滴，將其放置于37 ℃培養箱中固化10～20 min。每孔中加入500 μL肺鱗狀細胞癌類器官條件培養基，使其完全淹沒基質膠凝固液滴，最后置于37 ℃、含體積分數5% CO2培養箱中培養48 h。所有與獲取人肺鱗狀細胞癌標本相關的實驗程序均在蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會的監督和指導下完成，符合醫學倫理要求。獲取人肺鱗狀細胞癌標本已獲得患者知情同意。

1.4 慢病毒轉染人肺鱗狀細胞癌類器官將培養的人肺鱗狀細胞癌類器官分為對照組和TBRG4沉默組。對照組類器官轉染空載體慢病毒，TBRG4沉默組類器官轉染TBRG4沉默慢病毒，具體方法為：將含有慢病毒的肺癌類器官培養基與人肺鱗狀細胞癌組織單細胞懸液均勻混合，然后將其接種于48孔板中，用封口膜密封48孔板，32 ℃下2 000 r·min-1離心1 h，然后繼續培養6 h。最后按照“1.3”項所述方法對細胞進行肺鱗狀細胞癌類器官培養。72 h后用熒光顯微鏡觀察TBRG4在肺鱗狀細胞癌類器官中的沉默效率，培養2代后即可獲得穩定沉默目的基因的肺鱗狀細胞癌類器官。

1.5 CCK-8法檢測人肺鱗狀細胞癌類器官增殖活力取對照組和TBRG4沉默組類器官消化制備單細胞懸液，按每孔1 500個細胞接種到96孔板進行培養。對照組和TBRG4沉默組各鋪9個孔。分別在轉染24、48、72、96 h時，每孔加10 μL CCK-8試劑，繼續培養2 h，應用酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度值，繪制細胞活力曲線。每組設3個復孔，實驗重復3次，取均值。

1.6 Transwell法檢測人肺鱗狀細胞癌類器官的遷移和侵襲能力取2組轉染慢病毒后的人肺鱗癌類器官，消化制備單細胞懸液。將Transwell小室置于24孔板中。侵襲實驗前，取50 μL(18稀釋)基質膠鋪于小室內，4 ℃凝固后備用。遷移實驗無需鋪膠。收集轉染48 h的各組細胞，消化后制成3×108L-1的細胞懸液。向小室上室內加入200 μL的細胞懸液，下室加入500 μL的含20%血清的培養基,將含有小室的24孔板置于細胞培養箱常規培養24 h。取出小室，擦去上室面未過膜細胞，甲醇固定下室面15 min，結晶紫染色后置于顯微鏡下觀察并拍照，計算穿膜細胞數。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.7 Western blot法檢測人肺鱗癌類器官TBRG4、PCNA、PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白表達取2組轉染慢病毒后的人肺鱗癌類器官，消化制備單細胞懸液，收集細胞加入RIPA裂解15 min后提取細胞蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，調整蛋白濃度。取30 μg等量蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析細胞蛋白后，進行常規濕法轉膜。50 g·L-1脫脂牛奶室溫下封閉膜1 h，然后加入TBRG4、PCNA、PTEN、p-PI3K、p-AKT一抗稀釋液4 ℃ 孵育過夜。用TBST緩沖液洗膜后，加入二抗稀釋液室溫孵育1 h。洗膜后進行化學發光顯色。以β-actin作為內參對照，應用Image J軟件對目的蛋白進行量化，分析其表達水平。

2 結果

2.1 肺鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中TBRG4蛋白表達比較結果見圖1。肺鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中TBRG4蛋白的相對表達量分別為0.98±0.04、0.50±0.12，肺鱗狀細胞癌組織中TBRG4蛋白相對表達量顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(t=3.120，P<0.05)。

圖1 肺鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中TBRG4蛋白的表達

2.2 對照組和TBRG4 沉默組人肺鱗狀細胞癌類器官增殖活力比較結果見表1。 TBRG4沉默組人肺鱗狀細胞癌類器官在轉染24、48、72、96 h時的增殖活力均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 對照組和TBRG4 沉默組人肺鱗狀細胞癌類器官增殖活力比較

2.3 對照組與TBRG4沉默組人肺鱗狀細胞癌類器官的遷移和侵襲能力比較結果見圖2。TBRG4沉默組、對照組穿膜細胞數分別為(46.73±8.26)、(148.72±11.90)個，遷移細胞數分別為(38.64±7.92)、(178.53±10.87)個；TBRG4沉默組穿膜細胞和遷移細胞數均顯著少于對照組，差異有統計學意義(t=-8.220、-10.518，P<0.05)。

圖2 2組人肺鱗狀細胞癌類器官的侵襲和遷移情況

2.4 對照組和TBRG4沉默組人肺鱗狀細胞癌類器官中TBRG4和PCNA蛋白表達的比較結果見圖3和圖4。TBRG4沉默組和對照組人肺鱗狀細胞癌類器官中TBRG4蛋白的相對表達量分別為0.16±0.12、0.63±0.02，PCNA蛋白的相對表達量分別為0.530±0.243、1.390±0.560；TBRG4沉默組人肺鱗狀細胞癌類器官中TBRG4、PCNA蛋白的相對表達量均顯著低于對照組，差異有統計學意義(t=-3.214、-4.324，P<0.05)。

圖3 對照組和TBRG4沉默組人肺鱗狀細胞癌類器官中TBRG4蛋白的表達

圖4 對照組和TBRG4沉默組人肺鱗狀細胞癌類器官中PCNA蛋白的表達

2.5 對照組與TBRG4沉默組人肺鱗狀細胞癌類器官中 PTEN、p-PI3K、p-AKT相對表達量比較結果見表2和圖5。TBRG4沉默組人肺鱗狀細胞癌類器官中PTEN蛋白的相對表達量顯著高于對照組，p-PI3K、p-AKT蛋白的相對表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 對照組和TBRG4沉默組人肺鱗狀細胞癌類器官中PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白相對表達量比較

3 討論

使用靶向藥物治療肺癌可以提高部分臨床患者的生存率[7]，但耐藥性和藥物不良反應的存在仍然限制了其使用，患者的生存率仍較低，不超過15%[8]。基于此，深入研究肺癌發生發展的新機制和關鍵分子具有重要意義。小干擾RNA沉默技術是一種主要通過外源性小分子干擾RNA或內源性小分子RNA沉默靶基因的調控方法[9]。慢病毒載體具有低免疫原性，能轉染細胞并將攜帶的外源基因片段整合到宿主基因組中，因此，在基因工程中得到廣泛應用[10-11]。

TBRG4是位于7號染色體上可以編碼TGF-β調節子的基因。有研究報道，TBRG4不僅可以參與細胞周期調控，還可以維持細胞的穩定性[12]。張偉[13]研究表明，TBRG4可能通過調節線粒體mRNA的穩定性和細胞周期蛋白CLN1和CLN2的轉錄來調節細胞增殖。此外，TBRG4蛋白在多發性骨髓瘤患者髓外腫瘤組織[14]、原代乳腺癌細胞中[15]異常高表達，且其表達水平與乳腺癌的惡性程度呈正相關[15]。目前，成體組織來源的干細胞培養的類器官發展較為迅速，正逐漸成為研究疾病發生發展的良好模型。基于此，本研究采用沉默TBRG4基因的慢病毒對人肺鱗狀細胞癌類器官進行特異性干擾，以期探索TBRG4對肺癌生物學行為的影響。本研究結果顯示，沉默TBRG4基因能夠抑制人肺鱗狀細胞癌類器官的增殖，這表明TBRG4可以在體外抑制肺癌增殖；此外，沉默TBRG4基因還能夠抑制人肺鱗狀細胞癌類器官的侵襲和遷移能力。

PTEN具有脂質和蛋白的雙重特異性磷酸酶活性，是繼p53之后第2個被發現的抑癌基因。PTEN發揮作用的主要方式是調控多種信號通路，以此達到抑制腫瘤細胞增殖、轉移、黏附，促進腫瘤細胞分化、凋亡等目的[16]。研究發現，PTEN低表達是促進非小細胞肺癌發生和轉移的原因[17-18]。本研究結果表明，TBRG4基因敲低可能通過激活人肺鱗狀細胞癌類器官中PTEN的表達，進而下調p-PI3K、p-AKT等下游基因的表達，從而發揮抑制人肺鱗狀細胞癌類器官增殖、侵襲和遷移的作用。

綜上所述，TBRG4可能成為肺癌的潛在治療靶點，在調節肺癌的增殖、侵襲和遷移等方面發揮重要的作用，但其具體調節機制有待進一步深入研究。