“黃芪-丹參”對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化及低氧誘導因子-1 α表達的影響*

楊熙凱，王耀光

（1.天津市中醫藥研究院附屬醫院，天津 300120；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381）

慢性腎臟病（CKD）作為一個世界性的公共衛生問題，目前仍然沒有治療疾病的特效藥物或者其他根治手段，并且隨著疾病的發展，2%的患者會發展為終末期腎臟病（ESRD）[1]，給世界各國的衛生資源帶來了沉重的壓力。腎間質纖維化（RIF）是慢性腎臟疾病進展為終末期腎衰竭必經的病變過程，以腎臟間質中病理性的細胞外基質（ECM）過度沉積導致腎臟組織結構破壞和功能喪失為特征[2]，是攻克慢性腎臟病的一個重要難關。其中上皮細胞-間充質細胞轉分化是一個重要的細胞轉化過程，腎小管上皮細胞受刺激表型轉化后分泌促纖維因子并形成間質成纖維細胞[3]，是形成RIF的重要途徑，值得進一步探明其機制。

缺氧誘導因子（HIF）是一種在缺血或缺氧條件下適應性反應的因子[4]，在缺氧狀態下血管平滑肌大量分泌HIF-1α亞基，直接刺激其下游靶蛋白血管內皮生長因子（VEGF）高表達，從而參與血管再生、其次通過介導基質金屬蛋白酶（MMPs）、GSK/βcatenin信號通路的表達等方式調節細胞外基質的生成與重塑[5]，并且有研究表明，在HIF-1α高表達的轉基因小鼠中，觀察到了ECM的沉積以及間質成纖維細胞的活化，提示了RIF的發生[6]。所以研究其在RIF方面的相互作用及機制也存在較大意義，可能為RIF乃至CKD的診斷、治療提供新的作用靶點。

“腎疏寧”為全國名中醫黃文政教授根據“疏利少陽三焦”學說創立，在治療腎系疾病方面有著不錯的臨床療效[7-9]，同時基于療效的基礎實驗也從不同角度不同機制證明了“腎疏寧”的有效性，如腎疏寧能抑制系膜增生性腎炎大鼠模型細胞外基質的合成并促進其降解[10-12]。同時，本方蘊含了“補中寓消，消中有補”的治療思路，結合了補氣法及消瘀法。中醫以“癥瘕”論述RIF，補氣活血是最直接的治療手段。其中補氣、活血法代表藥物“黃芪-丹參”藥對則最可能為針對性藥物，也是實驗選擇藥物的理論依據。

故實驗基于“腎疏寧”對RIF的有效性，對方中補氣活血藥對“黃芪-丹參”進行分析，利用Masson染色、免疫組化等方法對單側輸尿管梗阻（UUO）大鼠腎臟各指標進行檢測，旨在研究UUO模型HIF-1α的改變以及“黃芪-丹參”藥對的腎保護作用。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與試劑 脫水機，武漢俊杰公司（JJ-12J）、包埋機，金華科迪公司（KD-BM）、梯度 PCR儀，美國ABI ProFlex公司（4484073）、熒光定量PCR 儀，瑞士 Roche公司（LightCycler96）、HP Total RNA Kit，美國 Omega Bio-Tek 公司（R6812-01）、HiFiScript cDNA Synthesis Kit，北京康為世紀公司（CW2569）、UltraSYBR Mixture（Low ROX），北京康為世紀公司（CW2601S）、Smooth Muscle Actin Rabbit Polyclonal Antibody，武漢 Proteintech公司（14395-1-AP）、GAPDH Rabbit Polyclonal antibody， 武 漢Proteintech公司（10494-1-AP）、Rabbit Anti-HIF-1 alpha antibody，英國 abcam 公司（ab179483）、辣根酶標記山羊抗兔IgG，北京中杉金橋公司（ZB-2301）。

1.2 實驗動物 選用大鼠為SPF級健康SD大鼠72只，雄性，體質量（190±10）g，購自北京斯貝福實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0002。飼養于天津市中西醫結合醫院動物房，實驗期間飲用水為清潔自來水、自由攝食，實驗室自然光照，室溫20～24℃左右，通風濕度良好，隔兩日更換1次墊料，大鼠購回后適應性喂養1周狀態良好后進行實驗。

1.3 實驗藥物 黃芪、丹參均購自天津中醫藥大學第一附屬醫院國藥堂。“黃芪-丹參”藥對依照腎疏寧[7]的中藥配伍比例，成人每日服藥用量為黃芪30 g，丹參30 g，每日總生藥量為60 g。旋蒸濃縮，將藥液濃度濃縮至1．8 g/mL，4℃保存，灌胃依照不同劑量稀釋。氯沙坦鉀片（科素亞）購自天津中醫藥大學第一附屬醫院西藥房。參考《藥理實驗方法學》通過人與大鼠間體表面積換算大鼠等效劑量，將氯沙坦鉀片用生理鹽水溶解，配制為1 mg/mL濃度溶液，4℃保存，灌胃時稀釋使用。

1.4 UUO模型制備 選取RIF常用大鼠適應性喂養1周后開始實驗，術前禁食不禁水12 h，將大鼠稱質量并記錄。使用生理鹽水將水合氯醛配置成10%水合氯醛溶液，按照0．3 mL/100 g的劑量對大鼠進行腹腔注射麻醉，麻醉后仰臥位固定，下腹部正中偏左備皮、后進行無菌操作，于大鼠左側肋腰點切開皮膚層、肌層至腹腔，翻開腸，找到左腎，在左腎下極鈍性剝離左側輸尿管，假手術組（Sham）剝離后不作處理，縫合肌層及皮膚層，碘伏及酒精消毒；其余組大鼠使用手術縫合線在輸尿管近腎盂段及輸尿管遠端分別結扎，縫合線間斷縫合肌層及皮膚層，碘伏及乙醇消毒，術后3 d予劑量為每鼠8萬單位的青霉素腹腔注射防止感染，以腎臟組織Masson染色觀察腎小管萎縮、RIF、間質浸潤、小管擴張的形成判定UUO模型造模成功。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 將72只大鼠依次編號，按照隨機數字表法將大鼠分為Sham、模型組（UUO）、芪參低劑量組（UUO+TCM-L）、芪參中劑量組（UUO+TCMM）、芪參高劑量組（UUO+TCM-H）、氯沙坦組（UUO+Losartan）共6組，每組12只。各組大鼠在手術后1 d開始灌胃，中藥參考《藥理實驗方法學》換算藥物濃度進行灌胃，具體如下：1）Sham與UUO組灌服生理鹽水。2）UUO+TCM-L：依照1/2等效劑量[2．7 g/（kg·d）]灌胃。3）UUO+TCM-M：依照等效劑量[5．4 g/（kg·d）]灌胃。4）UUO+TCM-H：依照2倍等效劑量[10．8 g/（kg·d）]灌胃。5）UUO+Losartan：依照等效劑量[9 mg/（kg·d）]灌胃。大鼠于給藥第13日灌胃后開始禁食不禁水，次日灌胃2 h后開始取材檢測。

2.2 腎臟病理標本的制作及Masson染色 使用4%多聚甲醛對腎臟組織進行固定，后經過脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟制作病理標本，切片后進行Masson染色，之后將染色后切片置于光鏡下觀察腎臟組織膠原纖維形成情況。對每個樣品，進行400×的顯微照相，鏡下隨機選取5個視野進行觀察，借助Image J軟件，計算腎組織膠原纖維占整個腎組織面積的百分比，得出膠原容積。

2.3 免疫組織化學法 將已固定的腎臟組織切片后脫蠟，使用0．01 mmol檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復，山羊血清封閉后加入一抗體α-SMA（1∶100稀釋），4℃過夜。使用生物素化二抗在37℃下孵育30 min，鏈霉卵白素工作液反應后。加二氨基聯苯胺法（DAB）顯色，后使用蘇木素復染，封片后鏡下觀察，本實驗使用免疫組化評分（IHS）對數據進行分析，該方法所得結果近似于基于圖像分析軟件的評分系統生成的數據[13]。通過將出現免疫反應細胞的百分比（數量得分）與染色強度的估計值（染色強度得分）相結合得出結果。如：數量得分以0～1%=0、1～10%=1、10～50%=2、50～80%=3、80～100%=4 記分；細胞染色強度得分以 0（陰性）、1（弱陽性）、2（陽性）、3（強陽性）計分。通過5個視野的閱片得出數量得分以及染色強度得分，兩者相乘為免疫組化積分。

2.4 聚合酶鏈式反應（PCR） 使用試劑盒提取法提取腎臟組織總RNA，運用HiFiScript cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄，實時定量PCR由Roche LC96系統進行。反應程序如下進行PCR：預變性95℃10 min，然后40個循環，每個循環包括變性95℃15 s，退火/延伸60℃1 min。PCR通過計算基因的相對表達量（2-ΔΔCt）分析結果：以GAPDH為內參基因，計算方法為：ΔΔCt＝ΔCt實驗組（目的基因 Ct值-內參基因Ct值）-ΔCt對照組（目的基因Ct值-內參基因Ct值）。引物序列通過NCBI網站查詢，運用BLAST進行序列比對、檢驗引物特異性。所獲得序列由上海生工公司代為合成。序列如下：

2.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測UUO大鼠腎臟組織中HIF-1α蛋白的表達 RIPA裂解腎臟組織，定量后制備蛋白樣品后上樣，通過10%SurePAGE預制膠電泳分離樣品，采用濕式電轉膜法將其轉移到PVDF膜上。快速封閉液封閉后，將PVDF膜4℃下與一抗孵育過夜。一抗Rabbit Anti-HIF-1 alpha antibody（1∶500 稀釋）、GAPDH Rabbit Polyclonal antibody（1∶10 000 稀釋）。過夜后二抗孵育 1 h，辣根酶標記山羊抗兔 IgG（1∶10 000 稀釋）。之后使用特超敏ECL化學發光試劑盒在成像儀平臺可視化蛋白質。應用Image J軟件測定目的條帶及相應內參的灰度值。結果以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。

2.6 統計學方法 利用SPSS 26．0統計分析軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，各組數據比較前先進行正態性及方差齊性檢驗。多組間差異比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），符合正態分布且方差齊時組間兩兩比較采用SNK檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗；不符合正態分布時使用非參數檢驗。P＜0．05為差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 Masson染色 染色藍色區域主要為膠原成分。Sham的膠原纖維主要出現在基底膜和系膜區，而與Sham比較，UUO大鼠可見大量藍色膠原纖維沉積，充斥于腎間質區域。治療組大鼠腎間質內的藍色膠原較模型組減少。通過對膠原容積的計算可知，UUO 與 Sham 比較，差異具有統計學意義（P＜0．001），UUO+TCM-L較UUO有改善，差異具有統計學意義（P＜0．05）；UUO+TCM-M、UUO+TCM-H 與 UUO 比較纖維化有改善，差異具有統計學意義（P＜0．01）；UUO+Losartan與UUO及UUO+TCM-H比較，差異具有統計學意義（P＜0．001）。見圖1。

圖1 Masson 染色及膠原容積情況（±s，×400）Fig.1 Masson staining and collagen volume（±s，×400）

3.2 免疫組化法檢測各組大鼠α-SMA蛋白表達情況 UUO手術后出現了α-SMA的高表達，蛋白的沉積主要出現在腎間質及腎小管上皮細胞。根據免疫組化積分，大鼠UUO相較Sham蛋白表達增加，差異具有統計學意義（P＜0．001），在服用芪參中、高劑量以及氯沙坦后蛋白表達均有改善，差異具有統計學意義（P＜0．01），UUO+TCM-L與UUO比較有改善，差異具有統計學意義（P＜0．05）。見圖2。

圖2 α-SMA蛋白表達及免疫組化反應積分（±s，×400）Fig.2 Expression level of α-SMA and IHS（±s，×400）

3.3 Real-time qPCR檢測各組大鼠Col1、FN mRNA的表達 UUO大鼠對比Sham，Col1、FNmRNA表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.001）；UUO+TCM-L與UUO比較時，差異具有統計學意義（P＜0.01）；對于Col1 mRNA表達的改善，UUO+TCM-M、UUO+Losartan均有較好效果，與UUO比較，有下降，差異具有統計學意義（P＜0.001）；在抑制FN mRNA表達方面UUO+TCM-M、UUO+TCM-H與UUO相比，均有改善，差異具有統計學意義（P＜0.01）；UUO+Losartan與UUO+TCM-H比較，差異具有統計學意義（P＜0.001）。見表1。

表1 Col1、FN mRNA 表達水平（±s）Tab.1 Col1 and FN mRNA expression levels（±s）

表1 Col1、FN mRNA 表達水平（±s）Tab.1 Col1 and FN mRNA expression levels（±s）

注：與Sham 比較，***P＜0.001；與 UUO 比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；與 UUO+TCM-H 比較，△△△P＜0.001。

分組 動物數 Col1 FN Sham 3 1.009±0.156 1.002±0.078 UUO 3 4.483±0.264*** 15.585±1.766***UUO+TCM-L 3 3.552±0.549## 2.987±0.136##UUO+TCM-M 3 2.543±0.135### 2.349±0.142##UUO+TCM-H 3 4.057±0.293 4.186±0.124##UUO+Losartan 3 1.846±0.239### 7.251±0.257#△△△

3.4 Western Blot檢測各組大鼠腎組織HIF-1α蛋白表達情況 實驗以觀察中藥在HIF-1α蛋白在腎臟組織中的表達，不涉及療效觀察，故不設置UUO+Losartan。UUO術后大鼠的HIF-1α蛋白表達水平明顯升高，UUO大鼠對比Sham，差異具有統計學意義（P＜0.001）；同時芪參組對于HIF-1α蛋白表達水平的升高具有一定的抑制作用，UUO+TCM-M較UUO有明顯改變，差異具有統計學意義（P＜0.01）；UUO+TCM-H較UUO有一定改善，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 HIF-1α 蛋白表達水平（±s，n=3）Fig.3Hif-1α protein expression level（±s，n=3）

4 討論

腎纖維化是所有CKD的發展過程，腎臟疾病的進展，本質上是腎纖維化的一步步加重，直至最終腎臟萎縮，失去其應有功能。腎纖維化過程中存在腎小球硬化、RIF、血管纖維化等方面的病理改變，RIF作為重要的一個環節存在著深入研究的價值。UUO模型，是通過結扎一側輸尿管引起尿路梗阻，造成腎臟結構的進行性破壞，出現RIF的模型。在嚙齒類動物中，UUO被認為是研究非免疫性腎小管間質纖維化機制最廣泛使用的模型[14]。其特點在于能夠快速的形成管狀萎縮和間質纖維化，出現細胞外基質沉積[15]。能迅速形成與人類疾病相似的纖維化事件[16]，故本研究使用SD大鼠的UUO模型進行RIF的研究。

在中醫理論研究中，RIF被歸為“癥瘕”的范疇[17]。葉天士在《臨證指南醫案》中強調“大凡經主氣，絡主血，久病血瘀”。說明瘀血是形成癥瘕的主要病機，治療時最宜補氣活血治之。就如唐容川《血證論》中強調：“瘀血在經絡臟腑之間，則結為癥瘕……即虛人久積，不便攻治者，亦宜攻補兼施，以求克敵。”腎疏寧雖以“疏利三焦”法立方，但腎臟疾病患者久病血瘀，雖有癥瘕不便破血行氣，故應當攻補兼施，補氣活血。選用黃芪、丹參作為方中臣藥，黃芪益衛固表，升陽舉陷，補養元氣、腎氣；丹參活血祛瘀，安神寧心。作為腎疏寧方中祛瘀“重臣”，“黃芪-丹參”藥對長于補氣活血，兩藥配伍，消補結合，祛除腎臟癥瘕。為“黃芪-丹參”藥對治療RIF提供了理論依據。

本研究結果顯示，UUO術后的大鼠出現了明顯的腎臟損傷，Masson染色提示腎臟組織中膠原纖維的產生，在Sham中可以看到少量膠原纖維出現在腎間質，用于穩定腎臟結構，是正常的生理結構。當輸尿管梗阻術后大量的膠原纖維產生，出現在了腎間質以及腎小球內。通過膠原容積的計算發現，中藥組在術后減輕了纖維化的沉積。長期以來，慢性缺氧一直被認為是各種類型慢性腎病的最終共同病理狀態。RIF造成了對腎小管周毛細血管的包圍與擠壓，血流的減少使得腎間質周圍各類細胞出現了缺氧，在本次UUO模型中也檢測到了缺氧誘導因子的表達，UUO對比Sham HIF-1α的表達明顯升高，同時越來越多的證據表明，HIF-1α是RIF的關鍵因素[18-20]。過表達的HIF-1α進一步加重了纖維化的進展[21]，并在臨床上展現了與慢性腎臟病的病情進展的相關性[22]。有證據顯示，在纖維化過程中，HIF-1α可誘導纖維化標志物（Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原）和轉分化標志蛋白（波形蛋白、平滑肌動蛋白）的改變[23-24]。實驗通過免疫組化觀察到，本應在腎小球系膜區少量表達的α-SMA在UUO術后高表達，并且異常出現在了腎小管上皮細胞，提示了UUO術后腎小管上皮細胞發生了表型轉化。說明了肌成纖維細胞的形成。同時利用PCR技術也檢測到了腎臟組織中Col1、FN出現了升高，作為細胞外基質的主要構成成分，以上兩指標的升高也提示了腎臟組織細胞外基質的異常增多。

而在UUO大鼠接受“黃芪-丹參”藥物治療后，RIF情況得到改善。目前已有人對“黃芪-丹參”藥對在腎間質纖維化的作用進行了研究[25]，周萍等[26]同樣使用大鼠UUO模型進行觀察，對成模大鼠進行“黃芪-丹參”藥對顆粒劑溶液灌胃治療，治療后大鼠腎功能水平較UUO改善，并促進了par-3蛋白表達，從而延緩腎間質纖維化。而在本次研究中，結果顯示當經過“黃芪-丹參”治療后，膠原纖維沉積減少，說明了“黃芪-丹參”藥對在治療RIF方面的作用；藥物治療可能一定程度緩解了受損腎臟組織的缺氧情況，HIF-1α的表達較UUO出現下降，且下降趨勢明顯；細胞外基質主要成分的過表達得到抑制、表型轉化標志蛋白表達降低，證明了中藥在抑制腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化上的良好作用。綜上所述，“黃芪-丹參”藥對可能通過改善缺氧情況，下調HIF-1α的表達，從而抑制細胞外基質的生成及減輕腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化，進而延緩RIF的進展。