基于網絡藥理學研究孔圣枕中丹“異病同治”失眠及健忘的作用機制*

陳晶，袁敏，侯志濤，2

（1.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，哈爾濱 150040；2.北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部和北京市重點實驗室，北京 100700）

失眠是全球最普遍的睡眠障礙，自從2019年以來，中國失眠的發生率顯著升高[1]。而且失眠是最廣泛的精神障礙之一，影響著人們的生理心理健康，往往會導致肥胖和糖尿病、自殺及心血管等疾病發病率的增加[2]。失眠一般指入睡和維持睡眠障礙，最早在《黃帝內經》中記載為“目不瞑”“不寐”，其主要病機是衛行于外，陽不入陰。《類證治裁·不寐》中論述為“不寐者，病在陽不交陰也”。心腎為水火之臟，水火者陰陽也，交通心腎，實則交通陰陽，陰陽交則寐。健忘則指較長時期內記憶力減退、遇事容易遺忘，古籍中稱為“喜忘”或“善忘”，常伴有失眠、心悸、頭暈等不適。清代林佩琴在《類證治裁·健忘》中指出：“治健忘者，必交其心腎，使心之神明，下通于腎，腎之精華，上升于腦，精能生氣，氣能生神，神定氣清，自鮮遺忘之失?！鼻医⊥Y可進行性加重發展為癡呆，給患者及社會造成較重的負擔。失眠和健忘雖然屬于兩種不同的疾病，但研究發現[3]在所有失眠患者中，健忘的伴發率超過了53.42%，是入睡功能障礙患者最主要的伴發癥之一。可見，臨床上多表現為失眠-健忘共病的患病特點。研究發現睡眠障礙和學習記憶功能存在顯著相關性，兩者可以相互影響；睡眠障礙的反復發作會影響患者正常的生理功能，還會導致記憶力等認知功能的下降；而記憶力下降等認知功能的損傷也會引起睡眠障礙[4]。

目前，對失眠主要采用認知行為療法、藥物干預、中醫藥干預等進行防治；但由于認知行為的治療費時、效果慢且無法普及，以苯二氮卓類、褪黑素受體激動劑和具有鎮靜抗抑郁等為主的藥物治療也存在著嚴重的不良反應大、依賴性強、復發率高等問題[5]；而中醫藥治療效果顯著，不良反應小，臨床應用廣泛。有關記憶力下降的發病機制尚不明確，臨床上治療此類疾病的靶向藥物尚未出現明確療效。孔圣枕中丹出自唐代孫思邈《備急千金要方·卷十四》，由龜板、龍骨、石菖蒲、遠志組成，具有補腎寧心，安神益智的功效。有關孔圣枕中丹的方解清·汪昂在《醫方集解》中論述：治讀書善忘，久服令人聰明……遠志苦泄熱而辛散郁，能通腎氣上達于心，強志益智；石菖蒲辛散肝而香舒脾，能開心孔而利九竅，祛濕除痰；又龜能補腎，龍能鎮肝使痰火散而心肝寧，則聰明開而記憶強矣。既往研究表明，孔圣枕中丹可用于治療失眠、癡呆、認知障礙、健忘及多動癥等多種疾?。豢资フ碇械び锌挂钟?、鎮靜催眠，以及提高癡呆大鼠學習記憶能力的作用[6-7]。目前，受到傳統研究方法的限制，尚未有文獻報道臨床上常見的失眠-健忘共病的發病機制。

網絡藥理學是基于系統生態學的理論基礎，通過對復雜生物信息系統的網絡分析，以及通過選擇特殊信息節點實現多靶點藥物分子設計的新興專業。同時，通過融合計算機技術、系統生物學、多方向藥理學等多種學科，構建成分-靶標-疾病的分子網絡，形成以網絡靶標為核心的技術體系，體現了中醫的整體論思想和中醫“同病異治”及辨證施治的特色，并為揭示證候本質提供了新的解決方案[8]。研究基于網絡藥理學，從“異病同治”角度對孔圣枕中丹治療失眠與健忘的作用機制展開了深入研究。

1 資料和方法

1.1 孔圣枕中丹活性成分及靶點的獲取 運用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.cn/tcmsp.php）和中藥成分靶點平臺HIT 2.0（http：//hit2.badd-cao.net）、中醫藥整合藥理學研究平臺（TCMIP，http：//www.tcmip.cn/index.jsp）、中醫綜合數據庫（TCMID，http：//www.megabionet.org/tcmid/）、有機小分子生物活性數據庫（PubChem，http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、臺灣中醫藥資料庫（TCM Database@Taiwan，http：//tcm.cmu.edu.tw）及中國天然產物化學成分庫（https：//pharmdata.ncmi.cn/cnpc）等平臺檢索孔圣枕中丹的4味中藥：遠志、石菖蒲、龜板、龍骨的活性成分?？诜o藥的生物利用度（OB）表示以口服藥物總劑量產生藥效的百分比，是藥物在藥代動力學中的主要參數；血腦屏障滲透性（BBB）是潛在物質透過血腦屏障的能力，人類藥性指數（DL）指化合物與已知藥物的相似性，被廣泛應用于評價藥物先導化合物能否成藥[9-12]。根據OB≥30%、BBB≥-0.3、DL≥0.1，篩選出同時滿足此條件的主要活性成分并檢索其潛在靶點。再通過Uniprot數據庫（http：//www.uniprot.org/），選擇物種為人（homo sapiens），獲取具有官方名稱的靶點信息。

1.2 失眠和健忘相關靶點的篩選 在治療目標數據庫（TTD，https：//db.idrblab.net/ttd/）、人類基因數據庫（GeneCards，https：//www.genecards.org/）、毒理基因組學數據庫（CTD，http：//ctdbase.org/）、藥物和藥物靶標信息數據庫（DrugBank，https：//www.drugbank.ca/）和人類的孟德爾遺傳數據庫（OMIM，http：//https：//www.omim.org/）數據庫獲取失眠及健忘的相關靶點，搜索關鍵詞“insomnia”“amnesia”“sleep disorder”“sleep deprivation”“cognitive impairment”“cognitive dysfunction”進行查詢，且去掉重復基因及假陽性基因。

1.3“藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建 將SCPE的藥物活性成分靶點與兩種疾病相關靶點取交集，以取得孔圣枕中丹治療失眠和健忘的共有靶點。以藥物、活性成分、作用靶點、疾病為節點（node），兩節點間的關系描述為邊（edge），并利用Cytoscape 3.7.1軟件構建孔圣枕中丹“異病同治”失眠及健忘的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，度數（Degree）和介數中心性（Betweenness Centrality）則用于進行對各節點間重要性的評價。

1.4 蛋白互作（PPI）網絡構建與關鍵靶點篩選 使用STRING數據庫解析SCPE治療失眠與健忘的潛在作用靶點，以及提取共同靶點蛋白互作的網絡圖，并使用Cytoscape3.7.1軟件，實現可視化以及拓撲解析；檢測出符合度和介數均大于各自平均水平的關鍵靶點。

1.5 生物過程分析 運用DAVID、Metascape等平臺對共有靶點進行分析和可視化，獲取Heatmap分析、Mcode（分子復合物檢測）分析、GO功能富集分析（即生物學過程、分子生物學功能、細胞學組分）與KEGG通路富集集分析結果。

2 結果

2.1 SCPE活性成分及靶點 篩選出39個活性成分，其中遠志（Polygala tenuifolia Willd）10個（C1-C10），石菖蒲（Acorus tatarinowii）24 個（C11-C34），龜板（Chinemys reevesii（Gray））2 個（C35-C36），龍骨（FossiliaOssia-Mastodi）3 個（C37-C39）；鑒于龍骨的主要成分Calcium Carbonate（碳酸鈣）和Calcium phosphate（磷酸鈣）在組方中的作用，雖無法透過血腦屏障，也分析其相應的治療靶點。經去重后獲得化合物對應的靶點88個，其SCPE活性成分和其對應的靶點，見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。

2.2 失眠和健忘相關靶點的獲取 通過TTD、CTD、DrugBank及GeneCards（人類基因的綜合數據庫）等數據庫檢索獲得失眠特異性疾病靶點24 771個，健忘特異性疾病靶點55 876個，并進行基因名稱標準化處理。通過Venny 2．1．0獲取SCPE中各組成藥物成分靶點與兩種疾病相關靶點的交集，獲得孔圣枕中丹治療失眠和健忘的作用靶點83個。

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建 使用Cytoscape 3．7．1軟件，建立了SCPE治療失眠及健忘的主要成分-靶點-疾病網絡圖并進行拓撲解析。此圖總共有135個節點、499條邊，其中與兩個或兩個以上的靶點有相互作用影響的藥物活性成分有31個。見圖1。

圖1 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖Fig.1 Drug-component-target-disease network diagram

圖中藥物成分所在位置對應外弧，而其中所對應的藥物靶點則位屬于內弧，其靶點量的多少也將對應于內弧的長度。深橙色點則是在各種中藥中反復出現的靶點，淡橙色則為僅存在于此中藥的靶點。紫色的光線連則連起反復出現的靶點，由此可見，石菖蒲、遠志、龜板和龍骨這幾種藥物擁有的共同靶點數量，依次是從多至少。而右圖中藍色的光線則連接反復出現的富集功能條目（富集條目數量＜100），各個藥物靶點的功能重疊狀況也隨之顯示。

2.4 蛋白互作（PPI）網絡構建及關鍵靶點 將83個SCPE治療眠和健忘的共有作用靶點導入STRING數據庫，并應用Cytoscape 3．7．1對蛋白互作網絡實行可視化數據處理及拓撲解析，見圖2。度的大小用節點的大小來顯示，即度越小越位于外圈；得到的SCPE治療失眠和健忘的關鍵共有靶點（Target）為符合度（Degree）和介數中心性（Betweenness Centrality）都大于平均數的18個靶點。見表1。由上可知，ESR1、CASP3、NOS3等是與SCPE治療失眠和健忘關系密切的主要蛋白。

圖2 SCPE治療失眠和健忘的蛋白互作網絡圖Fig.2 Protein interaction network diagram of SCPE for insomnia and amnesia

表1 SCPE治療失眠和健忘的關鍵共有靶點Tab.1 Key common targets of SCPE for insomnia and amnesia

2.5 生物過程富集分析 SCPE對治療失眠與健忘分子機制的深入探究，使用了DAVID、Metascape、R studio軟件等平臺，針對靶點分別做了GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。并將所得到的前20條富集條目建立了熱圖，從而利用Metascape和R studio對藥物中相應的靶點進行了富集和功能模塊化解析，得出了SCPE中治療失眠和健忘的潛在功能模塊（Mode）和各個藥物在模型中發生的可能相互作用機制。

2.5.1 聚類熱圖分析 將SCPE治療失眠和健忘的靶點做聚類分析，獲得前20條條目結果：乙酰膽堿反應、神經遞質水平的調控、化學突觸傳遞的調節、神經活性配體-受體相互作用、血液循環、蛋白轉運調控、溫度刺激反應、核受體信號等，更深入的解釋了SCPE在治療失眠和健忘時的復雜機制與過程。

2.5.2 GO富集分析 將SCPE對應的靶點導入R和R Studio軟件做GO富集分析，把SCPE治療失眠和健忘的前20條條目進行可視化，結果見圖3。其中，包括205個生物學過程（BP），主要有g蛋白偶聯受體信號通路、膽堿能突觸傳遞、平滑肌收縮的正向調節、胞漿鈣離子濃度的正向調節、γ-氨基丁酸信號通路、晝夜節律、脂質代謝過程、單胺運輸、T細胞激活等；包括78個分子學生物功能（MF），主要有蛋白結合、酶結合、泛素蛋白連接酶結合、乙酰膽堿結合、g蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性等；包括41個細胞學組分（CC），主要有核、突觸、GABA-A復雜受體、神經肌肉接頭、依賴camp的蛋白激酶復合物等。

圖3 SCPE治療失眠和健忘的GO富集分析氣泡圖Fig.3 GO enrichment analysis bubble diagram of SCPE for insomnia and amnesia

2.5.3 KEGG富集分析 將SCPE對應的靶點導入R和R Studio軟件做GO富集分析，把SCPE治療失眠和健忘的前20條條目進行可視化，結果見圖4。在SCPE治療失眠及健忘中發揮重要意義的信號通道，主要包括受體配體作用的神經活性、鈣信號通路、PI3K-Akt信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號通路、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路、膽堿能突觸等。

圖4 SCPE治療失眠和健忘的KEGG富集分析氣泡圖Fig.4 KEGG enrichment analysis bubble diagram of SCPE treatment for insomnia and amnesia

2.5.4 模塊化分析 運用R Studio軟件將聚類熱圖分析的成果進行了生物過程的模塊化分解，確定了在各種生物過程中不同藥物的具體效果和重要程度。如圖5和表2。

圖5 SCPE治療失眠和健忘生物功能的模塊化分析Fig.5 Modular analysis of the biological functions of SCPE for insomnia and amnesia

表2 SCPE治療失眠和健忘生物功能的模塊化分析表Tab.2 Modular analysis of biological functions of SCPE for insomnia and amnesia

利用GO富集分析每個模塊（MCODE）網絡，同時將每個MODE模塊的前3項相關條目進行解析。結果顯示，SCPE治療失眠和健忘主要與細胞對有機循環化合物的反應、激素反應及血液循環密切相關。具體到每個藥物的分析結果如下：石菖蒲靶點主要干涉了神經活性配體-受體相互作用、細胞對有機循環化合物的反應和神經遞質受體的活動過程；遠志靶點主要調節對激素的反應和細胞對氮及有機循環化合物的反應過程；龜板靶點主要影響胺受體配體結合和G蛋白偶聯胺受體活性及管徑調節反應過程；龍骨靶點主要介導凋亡和調節神經元凋亡過程。

3 討論

目前人們的生活和工作壓力隨著當今社會不斷的快速發展在逐漸增大，失眠健忘的發生率也呈明顯上升的趨勢。雖然失眠和健忘發病病機各有差異，有實有虛；歷代醫家認為心腎不交是失眠和健忘的主要發病病機之一，心主血而藏神，腎藏精而主志，心腎相交則寤寐協調，思維敏捷，若心腎不交則失眠健忘，并提出了相應的治療方藥如生慧湯、狀元丸、定志丸、導痰湯等[13]。孔圣枕中丹是經典復方，主治心腎不足而致失眠健忘、心悸不安，且歷史悠久，臨床應用廣泛，療效確切。針對心腎不交這一共同病機，孔圣枕中丹治療失眠-健忘充分體現了中醫辨證施治、“異病同治”的特點。

清代陳士鐸《石室秘錄》第一次明確提出了“異病同治”的概念，并將其定義為：“同治者，同是一方而同治數病也?！碑惒⊥巫鳛橹嗅t最基本的治療原則之一，至今仍應用于臨床的診斷和治療。異病同治的關鍵是抓主證，通過辨別主訴中的1組證候，認清疾病現階段的病機，辨證施治，從而確定治法、方藥，如此次證則迎刃而解。由于其具體作用機制尚不明確，并且傳統中草藥組成成分復雜、靶點不清，使其療效和作用機制的研究存在著一定困難，而網絡藥理學則可從中藥成分、靶點與病癥之間作用的整體與系統性關聯出發進行研究，有助于進一步發現中藥的復雜作用機制和實現異病同治的現代科學內涵。

本研究采用網絡藥理學方法對孔圣枕中丹進行分析，結果顯示SCPE中3個活性最強的物質為2'-O-甲基異甘草素（2'-O-Methylisoliquiriti-genin，C18），異紫花前胡內酯（Marmesin，C13），油酸（oleic acid，C35）；C18 和 C13 來源于石菖蒲，C35 則來源于龜板。動物實驗和藥理學研究發現[14-15]，石菖蒲能提高藥物在腦組織中的功效主要與保護血腦屏障和提高其通透性密切相關；而且具有降糖、抗阿爾茨海默病、抗癲癇、神經保護和記憶增強等作用。研究表明龜板能提高細胞免疫功能、調整β腎上腺素受體、清除氧自由基，以及緩解細胞凋亡[16-17]；Ye等[18]發現龜板提取物可通過調節DNMT1核易位和SNCA甲基化，來保護多巴胺能神經元。2'-O-甲基異甘草甙元是一個單體化合物，來自于黃酮類化合物異甘草苷。異甘草苷具有抗真菌活性、抗癌、抗抑郁及神經保護等作用[19-21]。異紫花前胡內酯是一種天然香豆素，具有抗炎、抗肝毒性、抗癌、抗血管生成等作用[22-25]。油酸是一種非必需脂肪酸，有抗炎、抗腫瘤、調節血壓和免疫功能等作用[26]。

通過蛋白互作（PPI）網絡圖可以觀察到排在前3位的共同靶點依次為CASP3、ESR1、PPARG，主要與細胞凋亡、雌激素反應、脂代謝有關。CASP3即半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，參與蛋白水解、細胞凋亡以及學習和記憶過程[27-28]。研究發現安眠丹可通過調節線粒體介導的海馬神經元凋亡通路和降低Cyt-C、Caspase-3表達來改善睡眠剝奪大鼠學習記憶水平[29]。ESR1即雌激素受體1，存在于與記憶、睡眠和清醒節奏相關的下丘腦、嗅葉、杏仁核和海馬區。臨床研究發現在AG XBA I或TC PVU II ESR1基因型的圍絕經期婦女中，失眠越嚴重，簡單注意力就越差[30]。PPARG即過氧化物酶體增殖物活化受體γ，可參與細胞分化和脂肪生成，胰島素抵抗，高血壓，以及心血管疾病和癌癥等過程[31]。另外Han等[32]發現母體睡眠剝奪（MSD）誘導的空間學習和記憶缺陷可以通過小膠質細胞表型的PPARγ依賴性調節來改善。

對靶點進行GO富集分析和KEGG富集分析的結果顯示，SCPE治療失眠及健忘的主要GO條目有G蛋白偶聯受體信號通路、核、突觸、蛋白結合、酶結合、泛素蛋白連接酶結合等；參與SCPE治療失眠及健忘的主要KEGG條目為受體配體作用的神經活性、鈣信號通路、PI3K-Akt信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號通路、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路、膽堿能突觸等。其中，腫瘤壞死因子（TNF）可介導炎癥反應和記憶障礙、調節神經元活動（如睡眠調節）等過程[33]；任重陽等[34]發現慢性失眠病人外周血中IL-6、IL-10、TNF-α等細胞因子水平與患者失眠程度、記憶功能呈正相關?？资フ碇械じ纳艭I小鼠的認知功能主要通過調控NLRP3/Caspase-1通路，減少血清中IL-6、IL-18和TNF-α等表達發揮作用[35]。細胞凋亡是體內細胞通過激活內部自殺程序而死亡的過程。研究表明，細胞凋亡與失眠、記憶障礙密切相關[36]。張穎等[37]發現左歸丸通過上調PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達，減少睡眠剝奪所致神經細胞凋亡，改善睡眠剝奪誘導的大鼠認知功能損傷。加味孔圣枕中丹提高血管性癡呆模型動物的學習記憶能力與對抗缺血再灌損傷后海馬區腦細胞的凋亡有關[38]。血管內皮生長因子（VEGF）[39-40]調控神經發育、血液和血管生成，與睡眠障礙和認知功能有關；VEGF的高表達可通過減少Aβ沉積，從而改善AD的學習和記憶等認知功能。實驗研究表明[41]加味孔圣枕中丹改善癡呆模型大鼠學習記憶能力的作用機制可能是通過上調VEGF表達，誘導腦組織新生血管生成，從而使皮質及白質缺血區的血供得以恢復和改善。

中樞神經遞質，如DA、NE、5-HT和GABA等功能失調時，會破壞節律神經，進而影響睡眠覺醒系統的一般功能，從而逐漸形成了不易入睡、睡眠維持障礙等以失眠最為常見的睡眠障礙[42]。多巴胺（DA）是最常見的興奮性神經遞質，主要產生于中腦邊緣系統的神經元中，對維持覺醒起著重要的調節作用；去甲腎上腺素（NE）參與注意力、覺醒和認知的調節，顯示出促進覺醒的能力；γ-氨基丁酸（GABA）是與失眠最直接相關的抑制性神經遞質之一，在大腦中普遍存在，且GABA濃度的增加，可增加深慢波睡眠[43-44]。Wang等[43]發現百樂眠通過調節神經遞質水平即 GABA，5-HT，DA，NE 含量升高，Glu含量降低來減輕氯苯丙氨酸誘導的失眠。另外，DA、GABA及NE參與學習和記憶過程，而且阻斷觸發DA刺激系統和以突觸后D-2受體為主的抑制性GABA能系統的激活等耦合過程是健忘癥發展的神經化學基礎[45-47]。Tellez等[47]發現記憶形成的機制可能與與前額葉皮質γ-氨基丁酸、紋狀體5-羥色胺、多巴胺等上調，海馬γ-氨基丁酸和5-羥色胺等下調有關；且參與抗健忘作用的主要神經傳遞系統是多巴胺和5-羥色胺。Sadowski等[46]研究發現利多卡因通過抑制杏仁核內去甲腎上腺素的釋放來減輕茴香霉素誘導的記憶障礙。

泛素化是指泛素分子在泛素激活酶（E1）、幾種泛素結合酶（E2s）和許多泛素連接酶（E3s）的協調催化下特異性修飾靶蛋白的過程。泛素連接酶E3，作為泛素化過程最后步驟中的重要酶，在與靶蛋白的特異性識別中起關鍵作用，且介導了癌癥、阿爾茨海默癥及帕金森病等多種疾病，目前仍是泛素化研究領域的熱門話題。E3泛素連接酶Cullin-3可在晝夜節律和睡眠調節中起重要作用，Li等[48]發現Cullin-3的適配器失眠inc家族蛋白能指導并影響睡眠和突觸功能的保守神經元底物泛素化。另外研究表明E3連接酶Neuralized1依賴性泛素化通過調節CPEB3和CPEB3依賴性蛋白質合成和突觸形成的活性來促進海馬可塑性和海馬依賴性記憶存儲[49]。由于泛素化系統的復雜性，很多問題仍有待研究，如采用傳統方法研究E3和底物之間復雜的交叉作用等。

由于泛素化系統的復雜性，很多問題仍有待研究，如采用傳統方法研究E3和底物之間復雜的交叉作用等。

總之，研究基于網絡藥理學預測發現孔圣枕中丹“異病同治”失眠及健忘可能通過抗細胞凋亡、炎癥反應、神經遞質、泛素蛋白連接酶結合等多種途徑發揮共同治療作用，與目前失眠及健忘的研究方向相同，表明了網絡藥理學預測結果的可靠性與準確性。但是尚不明確沒有靶點的化合物，是否發揮了同類型化合物的作用；且異病同治的機制研究由于受到復合模型穩定性等因素的限制，雖然進行了生物信息學的研究，但后續的動物模型及臨床研究仍需進一步深入。基于網絡藥理學的作用機制研究可為孔圣枕中丹臨床上新的應用提供參考，也為中藥復方“異病同治”科學內涵的詮釋提供了科學依據。