胃癌細胞中TWIST 慢病毒表達載體的構建及鑒定△

郭雪艷，藺敏，劉貴生，金燕，閻春英，高淑娟#

1陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710068

2寶雞市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 寶雞 721000

胃癌是消化系統(tǒng)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球新增胃癌患者108.9萬例，病死76.9萬例，亞洲約占50%[1]。胃癌已成為全球腫瘤的第三大死亡原因，中國是胃癌的高發(fā)國家，發(fā)病例數(shù)占全球的44.1%[1]。胃癌發(fā)生發(fā)展及多藥耐藥是非常復雜的過程，研究表明，多種分子參與了胃癌惡性表型及多藥耐藥網(wǎng)絡的形成。TWIST作為bHLH轉錄因子超家族的成員之一，現(xiàn)已被多種研究證實為癌基因。前期研究發(fā)現(xiàn)，TWIST在胃癌組織及細胞中高表達[2]，且在人胃癌耐藥細胞SGC7901/VCR中表達水平更高，可能與胃癌患者的多藥耐藥有關，參與了腫瘤細胞的浸潤和轉移過程[3]，但具體的分子機制不詳。本研究采用基因克隆技術及基因重組技術從胃癌多藥耐藥細胞SGC7901/VCR中克隆了人TWIST基因的全長序列，合成可在真核細胞中高表達的重組慢病毒載體，構建高濃度精確表達TWIST的慢病毒載體，為后續(xù)研究TWIST在胃癌多藥耐藥、轉移中的分子機制提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

E.coli DH5a感受態(tài)細胞、293T細胞、GV341慢病毒表達載體及AgeI/NheI酶切均購自上海吉凱基因化學技術有限公司，胃癌耐藥細胞系SGC7901/VCR由第四軍醫(yī)大學腫瘤重點實驗室聶勇戰(zhàn)教授惠贈。總RNA提取試劑盒、包裝載體純化試劑盒均購自德國Qiagen公司，逆轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、Plasmid抽提Kit均購自美國普洛麥格公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，In-Fusion?PCR Cloning Kit購自美國康迪泰克公司，1 kp DNA Ladder Marker購自美國Fermentas公司，250 bp DNA Ladder Marker、Primer均購自上海捷瑞生物工程有限公司，瓊脂糖購自賽百盛公司，Taq polymerase購自北京義翹神州科技股份有限公司，脫氧核糖核苷三磷酸（dexoyribonucleoside triphosphate，dNTP）購自日本Takara公司，限制性內(nèi)切酶購自美國New England Biolabs公司，臺盼藍購自上海捷倍思基因技術有限公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、胎牛血清均購自上海微科生化試劑有限公司，DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，脂質(zhì)體2000購自美國Invitrogen公司，F(xiàn)lag單克隆抗體購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗購自美國Santa Cruzigma公司，ECL-PLUS/Kit購自Amersham公司。

1.2 重組慢病毒表達載體GV341-TWIST的構建

1.2.1 載體酶切 選用高效慢病毒表達載體GV341，元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin，克隆位點：AgeI/Nhe。

1.2.2 目的基因片段獲取 參考Genbank的TWIST1（BC036704）基因序列設計一對TWIST全基因擴增序列，上游引物5'-CCAACTTTGTGCCAACCGGTCGCCACCATGATGCAGGACGTGTCCAG-3'，下游引物5'-AATGCCAACTCTGAGCTTGTGGGACGCGGACATGGAC-3'，其中交換配對堿基、酶切位點、用于PCR釣取的目的基因5'端部分序列，由上海吉凱生物化學公司合成，聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）法純化引物。PCR反應：94℃預變性5 min，55℃30 s，72 ℃ 2 min，再延伸 10 min，共 30個循環(huán)，TWIST PCR產(chǎn)物-20℃保存待檢。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并使用凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶。

1.2.3 重組質(zhì)粒構建及鑒定 將純化后的TWIST PCR產(chǎn)物及酶切后線性載體DNA、In-Fusion交換酶、10×In-Fusion交換酶緩沖液、ddH2O加入反應體系，反應條件：25℃水浴30 min，42℃水浴5 min中止反應，目的是將TWIST PCR產(chǎn)物交換入線性化表達載體。以ddH2O為陰性對照，以空載體為空載體自連對照，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為陽性對照。完成后再以上游引物5'-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3'、下游引物 5'-CAACCGAGAAGGCGTAGC-3'序列進行PCR擴增，得到陽性轉化子PCR產(chǎn)物，并將其送往上海吉凱生物化學有限公司進行測序以鑒定基因的準確性。

1.3 重組慢病毒載體GV341-TWIST的表達及病毒滴度檢測

1.3.1 293T細胞轉染 選擇生長狀態(tài)良好的293T細胞進行傳代培養(yǎng)，當細胞密度達到70%～80%時，將細胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基；將陽性轉化子PCR克隆產(chǎn)物（DNA）與相應體積的Opti-MEM混合均勻，將 100 μl脂質(zhì)體 2000 加入至 2.4 ml的Opti-MEM減血清培養(yǎng)基中，在室溫條件下孵育5 min后將兩者的混合液混合，然后靜置20 min形成DNA與脂質(zhì)體2000稀釋液的轉染復合物，移至293T細胞培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞；8 h后倒去含有轉染混合物的培養(yǎng)基，加入20 ml的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌殘余的轉染混合物，棄去；加入含10%血清的細胞培養(yǎng)基25 ml，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收集細胞上清，4℃、4000 r/min離心10 min，去除細胞碎片，過濾、離心后收集病毒濃縮液，-80℃貯存。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測TWIST蛋白的表達水平 分別收集轉染和未轉染GV341-TWIST的293T細胞，離心沉淀后使用超聲破碎，使蛋白變性；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉移到硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h后，加入Flag一抗（稀釋濃度為1∶3000）4℃孵育過夜。TBST沖洗3次，每次10 min，加入羊抗鼠IgG的二抗（1∶4000稀釋）室溫孵育1 h，TBST沖洗3次，每次10 min，加入發(fā)光液，凝膠成像儀成像。

1.3.3 實時PCR 檢測重組慢病毒載體GV341-TWIST 病毒滴度 收集感染和未感染重組慢病毒載體GV341-TWIST的293T細胞，提取總RNA，逆轉錄得到互補DNA（complementary DNA，cDNA），用于擴增WRPE（WRPE是慢病毒的元件之一，可以作為實時PCR檢測的目標基因從而進行慢病毒感染樣品的檢測）的引物序列：上游引物5'-AATTCCGTGGTGTTGTCG-3'，下游引物 5'-AAGGTCCGCTGGATTGAG-3'，被擴增片段位置371～493 bp；對照Actin引物（NM_001101）序列：上游引物5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，下 游 引 物 5'-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3'，被擴增片段位置932～1233 bp。PCR反應體系為20.0 μl，包括SYBR緩沖液 10 μl，上下游引物各 1.0 μl，cDNA 1.0 μl，ddH2O 7.0 μl；反應條件：95 ℃預變性15 s，95 ℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)。反應結束后建立熔解曲線（反應條件：95℃1 min，冷卻至55℃，從55℃開始到95℃，每次增加0.5℃，30 s增加一次）。反轉錄得到20 μl cDNA，取1 μl用于實時定量逐孔稀釋測定Ct值，根據(jù)各組Ct值計算滴度，這一結果表示1/20樣品的情況，滴度計算時再乘以20。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TWIST 基因片段的獲取

從高表達TWIST的人胃癌多藥耐藥細胞SGC7901/VCR中克隆，擴增TWIST基因編碼區(qū)全序列的DNA片段，其片段大小約為651 bp，酶切后電泳，在651 bp處可見載體酶切產(chǎn)物特異性條帶。（圖 1）

圖1 TWISTPCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 重組慢病毒表達載體GV341-TWIST的構建

將TWIST PCR產(chǎn)物交換入線性化表達載體進行PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳，陽性轉化子PCR產(chǎn)物大小為706 bp（圖2）。陽性克隆測序結果顯示，重組質(zhì)粒中插入的TWIST序列與Genbank中的序列完全一致。

圖2 陽性轉化子PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 重組慢病毒表達載體GV341-TWIST轉染293T 細胞

將重組慢病毒表達載體GV341-TWIST轉染入293T細胞48 h后，可見部分細胞融合，并出現(xiàn)多核復合體；熒光顯微鏡下觀察到感染病毒后細胞內(nèi)大量綠色熒光蛋白，轉染率＞80%。（圖3）

圖3 重組慢病毒表達載體GV341-TWIST感染293T細胞后TWIST的表達情況（×200）

2.4 Western blot法檢測TWIST蛋白的表達水平

重組慢病毒表達載體GV341-TWIST轉染細胞在25 kD附近有大小與TWIST融合蛋白相吻合的特征條帶，而陰性對照細胞不能檢測到TWIST融合蛋白的表達。

2.5 實時PCR 測定病毒滴度

樣品顏色同PCR曲線顏色，在本次滴度檢測中，10-4μl組和對照樣品間Ct值存在差異，認為在10-4μl組樣品中存在病毒顆粒（圖4A）。假定該組樣品含有至少1個病毒顆粒，則病毒的滴度為：1/（1.00E-04）×20=2.00E+5 TU/μl=2.00E+8 TU/ml。目的基因溶解曲線及Actin基因溶解曲線分別如圖4B及圖4C，圖中沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰異常增寬，表明實驗中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴增。

圖4 實時PCR測定TWIST 重組慢病毒滴度

3 討論

隨著日常生活環(huán)境的不斷變化，細胞隨著自身環(huán)境的變化也在不斷更新自身結構功能，以更好適應現(xiàn)在所處條件或更好地與人類對抗。人類在不斷研發(fā)胃癌新治療方案的同時，人體細胞也在不斷偽裝包裝自身，細胞形式各式各樣，因此，不僅要加緊研發(fā)治療方案，還要時刻監(jiān)測細胞本身的變化。TWIST作為高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子，是于1983年在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，其對果蠅胚胎發(fā)育的細胞重建及遷移具有重要作用[4]。隨后在水蛭、文昌魚、秀麗隱桿線蟲、非洲蟾蜍、小鼠及人類細胞中相繼發(fā)現(xiàn)了TWIST基因的同源物[5-10]。脊椎動物有TWIST1和TWIST2（也稱之為dermo-1）2個蛋白[11]。

在正常生理情況下，TWIST主要表達于胚盤、胚胎中胚層和成年人的某些中胚層來源的未分化組織中。TWIST基因突變可導致Saethre-Chotzen綜合征，是一種過早融合頭骨的遺傳性疾病，這一種遺傳障礙表現(xiàn)為四肢異常、頭和顏面不對稱以及顱縫融合不成熟等[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，TWIST也在乳腺癌、肝細胞癌、肺癌、食管癌、胃癌、膽管癌、骨肉瘤、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中表達上調(diào)[14-15]，并與患者的預后密切相關。本實驗發(fā)現(xiàn)，TWIST在胃癌細胞及耐藥SGC7901/VCR細胞中高表達，在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮原癌基因的作用，其表達還可促進胃癌細胞耐藥及轉移，目前具體分子機制尚不明確[16-17]。也有研究顯示，TWIST可能通過促進上皮-間充質(zhì)轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）轉化調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，對胚胎發(fā)育過程中的組織重建和細胞遷移能力有至關重要的調(diào)節(jié)作用[18]。TWIST具有EMT或腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）特征，是EMT和CSC所需的關鍵轉錄因子[19]。研究顯示，TWIST將成為治療腫瘤耐藥性轉移性的有效靶點[20]。Wang等[14]為探索TWIST與MDR基因相關蛋白之間的關系，構建了hTWIST cDNA的pcDNA5/FRT/TO載體，結果發(fā)現(xiàn)，TWIST可能通過調(diào)節(jié)MDR基因相關蛋白的表達來促進腫瘤細胞和組織的耐藥性。

既往本研究組曾構建TWIST原核表達載體，但因其表達效率較低，影響后期功能實驗[21]。因此，本研究從胃癌多藥耐藥細胞SGC7901/VCR中擴增出人TWIST基因，與GV341質(zhì)粒酶切后成功構建TWIST重組慢病毒表達載體GV341-TWIST，將其轉染至293T細胞，熒光顯微鏡下觀察其轉染效率＞80%，包裝后獲得滴度為2.00E+8 TU/ml的慢病毒載體；通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)TWIST蛋白在293T細胞中高表達。高效TWIST慢病毒表達載體的成功構建與成功包裝可為TWIST在胃癌細胞高表達提供工具，為后期研究TWIST基因在腫瘤細胞發(fā)生、侵襲、轉移中的作用機制奠定基礎[22-23]。

綜上所述，本研究成功構建并包裝了TWIST慢病毒高效表達載體，為TWIST在腫瘤中的功能研究提供高表達工具。