基于網絡藥理學探討童心康合劑治療小兒病毒性心肌炎的作用機制

宋惠霄，劉艷紅，由笑蕊，李燕寧

小兒病毒性心肌炎是由病毒感染引起的，以局限性或彌漫性心肌炎性病變為主的疾病，各年齡段均可發病，以3～10歲多見，臨床表現輕重不同，積極治療后多數患兒預后良好，少數呈急性暴發性發病，病情危重，短時間內死亡或遺留頑固性心律失常等，嚴重影響兒童身心健康。中醫學雖無“病毒性心肌炎”病名，根據病因及臨床癥狀，該病歸屬于“心悸”“怔忡”“心痹”“胸痹”等范疇，中醫藥辨證施治療效肯定。本研究基于網絡藥理學探討童心康合劑治療小兒毒瘀互結、氣陰兩虛型病毒性心肌炎的作用機制。

1 資料與方法

1.1 西醫診斷標準 參照1999年9月全國小兒心肌炎、心肌病學術會議制定的小兒病毒性心肌炎診斷標準[1]。

1.2 中醫辨證標準 小兒病毒性心肌炎毒瘀互結、氣陰兩虛證辨證標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[2]：神疲乏力，心悸，氣短，面色蒼白胸悶或胸痛，肢冷，多汗，等；主癥：心悸，胸悶或胸痛，嘆息；次癥：乏力，氣短，懶言，多汗，煩躁，咽痛(紅)。具備主癥1項及次癥2項，可辨證為毒瘀互結、氣陰兩虛證。

1.3 病毒性心肌炎臨床分型輕型標準 無明顯自覺癥狀，偶發期前收縮或一過性心電圖ST-T改變；患兒多表現為肢體無力、汗出過多、面色蒼白、心悸、氣短、胸悶、頭暈等；檢查可見面色蒼白、口周發青、心尖部第一心音低鈍，伴有期前收縮或Ⅰ度、Ⅱ度房室傳導阻滯、輕度ST-T改變[2]。

1.4 病例納入標準 符合小兒病毒性心肌炎西醫診斷標準或臨床診斷為病毒性心肌炎；符合中醫小兒病毒性心肌炎毒瘀互結、氣陰兩虛證；符合小兒病毒性心肌炎臨床分型輕型；年齡1～14歲；病程≤1個月；患兒監護人知情同意。

1.5 病例排除標準 不符合納入標準或資料不全影響判斷；合并嚴重原發疾病及精神病；本研究前3個月內參與過藥物臨床研究；白細胞計數≥12×109/L，中性粒細胞百分比>70%，疑似細菌感染的患兒；過敏體質(對2種以上食物、藥物過敏)；根據接診醫生分析，易失去有效聯系人；年齡<1歲或>14歲等。

1.6 一般資料 選取2015年1月—2018年11月山東中醫藥大學附屬醫院、山東中醫藥大學附屬第二醫院、濟南市第三人民醫院及濟南市第四人民醫院病毒性心肌炎患兒99例，隨機分為童心康組(應用童心康合劑)和玉丹組(應用玉丹榮心丸)。童心康組48例，男25例，女23例；年齡1～10(4.87±2.80)歲；病程(14.85±3.00)d。玉丹組51例，男26例，女25例；年齡1～14(4.85±3.12)歲；病程(15.59±2.71)d。兩組性別、年齡、病程比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.7 治療方案 童心康合劑由炙黃芪、麥冬、丹參、板藍根、炙甘草5味中藥按3 ∶2∶2∶2∶1組成(山東省中醫院西區制劑室生產，規格：每瓶100 mL)；用法：1～3歲4 mL，每日3次；4～6歲7 mL，每日3次；7～14歲10 mL，每日3次。玉丹榮心丸(上海玉丹藥業廠生產，國藥準字Z10970095)由玉竹、丹參、五味子、降香、苦參、大青葉、山楂、炙甘草8味中藥組成；用法1～3歲2丸，每日3次；4～6歲3丸，每日3次；7～14歲4丸，每日3次。兩種藥物符合有效、同類、可比原則。兩組以4周為1個療程。

1.8 觀察指標 觀察兩組治療前后中醫證候改善情況，主癥、次癥按無、輕、中、重計分，統計證候改善率及單項癥狀療效；觀察兩組治療前后肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心電圖、心臟彩超及血尿便常規、肝腎功能；記錄研究過程中兩組不良事件發生情況。

1.9 療效判定標準 中醫療效判定，根據公式：中醫證候改善率=(治療前總積分-治療后總積分)/治療前總積分×100%。臨床治愈：中醫證候積分減少>95%；顯效：中醫證候積分減少70%～95%；有效：中醫證候積分減少30%～69%；無效：中醫證候積分減少<30%。單項癥狀療效判定，痊愈：癥狀消失；顯效：癥狀明顯好轉(積分降低2個等級)；有效：癥狀好轉(積分降低1個等級)；無效：治療癥狀無變化或加重。

2 結 果

2.1 兩組中醫證候積分及CK-MB比較 治療前，兩組中醫證候積分及CK-MB比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。治療后，兩組中醫證候積分及CK-MB較治療前降低(P<0.05)。詳見表1。說明童心康合劑及玉丹榮心丸均可改善病毒性心肌炎患兒臨床癥狀及CK-MB，療效顯著，且兩組等效。

表1 兩組中醫證候積分及CK-MB比較(±s)

2.2 兩組中醫療效比較 兩組中醫療效比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。說明童心康合劑和玉丹榮心丸治療小兒病毒性心肌炎療效相當。

表2 兩組中醫療效比較

2.3 兩組治療前后中醫單項主要癥狀比較 3項中醫單項主要癥狀樣本量較少，不符合等級資料兩樣本比較秩和檢驗統計學方法的要求。兩組3項主癥改善情況僅用痊愈率比較，詳見表3。說明玉丹榮心丸治療心悸痊愈率略高于童心康合劑。

表3 兩組治療前后中醫單項主要癥狀比較

2.4 兩組治療前后肝腎功能比較 兩組治療前后肝、腎功能主要指標均在正常范圍內，故兩者安全性值得肯定。

2.5 兩組依從性情況比較 治療期間，每次發放1周藥物，1周后復診，記錄患兒癥狀體征，療程4周，5例因未按要求服藥中途剔除，研究結束時共納入患兒99例。

2.6 不良反應 兩組患兒均未發生嚴重不良反應。

3 基于網絡藥理學探討童心康合劑治療小兒病毒性心肌炎的作用機制

3.1 方法

3.1.1 獲取童心康合劑活性成分及靶點 利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP，lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、TCMID數據庫(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)和DrugBank數據庫檢索童心康合劑各藥物含有的化學成分。在TCMID數據庫檢索麥冬、丹參、炙黃芪、炙甘草的有效成分；在TCMSP數據庫檢索丹參、板藍根的有效成分，在DrugBank數據庫檢索丹參、炙甘草的有效成分。根據口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)進行篩選，設置閾值：OB≥30%、DL≥0.18。將獲得的對應smile碼輸入到SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測靶點數據庫中，得到與藥物對應的靶點。從DrugBank數據庫得到的有效成分需要將CAS號通過化源網查找分子式，再通過SwissTargetPrediction預測相關靶點。

3.1.2 病毒性心肌炎靶點 使用GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫，以疾病名稱“病毒性心肌炎(viral myocarditis)”檢索相關基因，GeneCards數據庫中Relevance score評分越高，說明此基因對本病的研究價值越高。

3.1.3 童心康合劑治療病毒性心肌炎靶點 利用Venny 2.1在線工具進行童心康合劑活性成分靶點和病毒性心肌炎相關靶點映射并繪制韋恩圖，將兩部分交集靶點作為童心康合劑治療病毒性心肌炎靶點。

3.1.4 藥物-成分-靶點網絡構建 將單味藥、活性成分、作用靶點信息導入Cytoscape繪制單味藥-活性成分以及活性成分-作用靶點網絡圖，采用Cytoscape軟件Merge功能繪制最終的單味藥-活性成分-作用靶點網絡，基于構建的網絡分析童心康合劑治療病毒性心肌炎的作用機制。

3.1.5 蛋白-蛋白互作網絡(protein-protein interaction network，PPI network) 利用STRING平臺將交集靶點構建PPI網絡，組合分數閾值>0.4。應用Cytoscape軟件繪制PPI網絡，應用“Network Analyzer”功能對PPI網絡進行拓撲結構分析，計算網絡整體的節點度值分布(node degree distribution)和介數中心性(betweenness centrality)兩個重要拓撲參數，以Degree和betweenness為參數分析童心康合劑治療病毒性心肌炎的關鍵靶點，設置節點大小與顏色反映度值(Degree)大小，最終獲得PPI網絡。

3.1.6 童心康合劑治療病毒性心肌炎靶點生物學功能富集分析 利用R語言{packages(“RSQLite”)}等多個工具包，將得到的交集基因進行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，并進行可視化處理。

3.2 結果

3.2.1 童心康合劑活性成分及靶點分析 通過TCMID、TCMSP及DrugBank數據庫對童心康合劑5種中藥進行活性成分檢索，其中丹參312個、板藍根180個、麥冬55個、炙黃芪2個、炙甘草17個。對應1 095個靶點。

3.2.2 童心康合劑治療病毒性心肌炎靶點分析 在GeneCards疾病靶標數據庫中得到病毒性心肌炎相關基因靶點1 096個。繪制韋恩圖得到童心康合劑治療病毒性心肌炎靶點236個。詳見圖1。

圖1 童心康合劑活性成分與病毒性心肌炎靶點的韋恩圖

3.2.3 童心康合劑活性成分-作用靶點網絡分析 采用Cytoscape軟件的Merge功能繪制童心康合劑活性成分-作用靶點網絡圖，得到440個節點、4 363條邊的網絡，5味中藥的199個活性成分作用于236個靶點上。詳見圖2。

圖2 童心康合劑活性成分-作用靶點網絡圖

3.2.4 PPI網絡分析 將韋恩圖中236個童心康合劑治療病毒性心肌炎的靶點導入STRING平臺，得到PPI網絡圖，詳見圖3。輸出(string_interactions.tsv)核心基因，使用R語言運行篩選出與疾病相關的30個基因，詳見圖4。連線數越多，說明該基因越處于核心位置，即該基因對疾病作用的意義越大。居前10位的分別是白細胞介素-6(IL-6)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、清蛋白(ALB)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、腫瘤蛋白53(TP53)、表皮生長因子受體(EGFR)和胱天蛋白酶3(CASP3)。提示這些核心靶點可能是童心康合劑治療病毒性心肌炎的主要途徑。

圖3 PPI網絡圖

圖4 核心基因可視化分析圖

3.2.5 富集信號通路分析 利用R語言安裝{packages(“RSQLite”)}等工具包，將基因symbol轉為基因ID，將得到的基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析篩選得到20個過程，包括與內肽酶活力改變、細胞因子受體結合、與蛋白絲氨酸激酶活性、磷酸酶綁定、蛋白二聚體活性等，繪制柱狀圖及氣泡圖，其中P值越小顏色越紅，表明功能富集越大，詳見圖5、圖6。利用R語言運行KEGG相關腳本，得到176條通路，包括與人類巨細胞病毒感染、流感病毒A感染、細胞凋亡(見圖7)、C型凝集素受體信號通路、T細胞受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

圖6 GO功能富集分析氣泡圖

圖7 細胞凋亡

4 討 論

小兒病毒性心肌炎是由柯薩奇病毒、腺病毒、副流感病毒等感染引起的心肌炎性病變，輕者在查體中發現心律失常，患兒無明顯不適，重者突然出現心源性休克、心腦綜合征等危重癥，甚則猝死，是嚴重威脅兒童身心健康的疾病。現代醫學尚無特異性治療方法，中醫藥在抗病毒、減輕心肌炎癥、降低免疫反應、防治心肌纖維化等方面療效顯著，得到廣大醫患的認可。中醫學中無此病名，根據臨床表現歸屬于“胸痹”“心悸”“太息”“溫病”等病證辨治。《小兒藥證直訣》[3]記載五臟主病：“心主驚。實則叫哭發熱，飲水而搐，虛則臥而悸動不安……心病，多叫哭，驚悸，手足動搖，發熱飲水”。《兒科要略》記載：“心痛者曲身護其胸，大痛者爬床而搔席[4]”，發病情況與病毒性心肌炎發作時癥狀類似。李燕寧教授從醫30余載，治療小兒病毒性心肌炎頗有心得，認為本病病機為毒瘀互結、氣陰兩虛，此病理變化貫穿各個分期。急性期外感熱毒從口鼻、鼻咽而入，毒傷心絡，傷心體損心用，致氣陰兩虛，氣陰兩虛為本，邪毒侵襲為標，此期標實為主；遷延期毒瘀互結，以瘀為主，濕毒、痰毒、濁毒內生，虛實標本夾雜；慢性期病情遷延，氣陰兩虛明顯，仍有毒瘀，且反復感受外毒，本虛為主，兼夾毒瘀。

李燕寧教授根據疾病病因病機提出解毒活血、益氣養陰的治則，精心選藥組成童心康合劑，臨床療效顯著。李燕寧教授強調本病遷延期、慢性期均為急性期熱毒未清所致，瘀血的產生與熱毒密切相關，故清熱解毒至關重要，提出“祛邪務盡”，防止病情進一步發展。本病急性期瘀血征象不明顯，現代研究已證實急性期炎癥細胞浸潤，心肌壞死，心肌纖維溶解，心肌微循環障礙已存在，故李燕寧教授主張活血化瘀藥在疾病初期即用，強調其應用貫穿始終，以防由瘀致毒，毒瘀互結，損傷正氣。熱毒侵襲致心之氣陰兩傷，如小兒先天稟賦不足、氣陰虧虛，或病后調護不周致氣陰損傷，更易感受熱毒，故李燕寧教授臨證早期應用大劑量炙黃芪，伍以麥冬，一則補心氣、養心陰，扶正防復感外毒；二則氣陰充足可托毒外出，防氣虛血運不暢留而為瘀或陰虛血少澀而為瘀，加重病情惡化。

童心康合劑是由炙黃芪、麥冬、丹參、板藍根、炙甘草5味中藥按3∶2∶2∶2∶1組成。方中炙黃芪、麥冬為君，且炙黃芪使用量最大，兩藥合用培本益氣養陰療效顯著。臣以丹參活血化瘀，佐以板藍根清熱解毒，使以炙甘草調和諸藥，補脾益氣復脈。

玉丹榮心丸是由上海玉丹藥業廠生產，由玉竹、丹參、五味子、降香、苦參、大青葉、山楂、炙甘草8味中藥組成，具有益氣養陰、活血化瘀、清熱解毒、強心復脈的功效。治療氣陰兩虛或氣陰兩虛兼心脈瘀阻所致胸悶、心悸、氣短、乏力等證，適用于病毒性心肌炎、心肌病、心肌損傷、心律失常、反復呼吸道感染、早期復極綜合征等疾病的治療。劉大為[5]觀察23例病毒性心肌炎患兒，在基礎治療基礎上加用玉丹榮心丸治療，可明顯改善患兒臨床癥狀。葛安霞等[6]觀察302例病毒性心肌炎患兒，觀察組給予玉丹榮心丸治療，對照組服用生脈飲，結果顯示，觀察組臨床癥狀、體征改善，心肌酶及心電圖恢復方面均優于對照組，表明玉丹榮心丸治療病毒性心肌炎療效顯著，且為臨床醫生及病人所肯定，故本研究選擇玉丹榮心丸作為對照組用藥，99例患兒隨機分組臨床觀察，結果童心康合劑與其同效，療效顯著。

病毒性心肌炎發病機制尚未明確，根據本研究結果與病毒感染、免疫反應、心肌纖維化、細胞凋亡等有關。網絡藥理學分析童心康合劑治療病毒性心肌炎的核心靶點包括IL-6、AKT1、GAPDH、TNF、MAPK3、ALB、VEGFA、TP53、EGFR、CASP3等。其中IL-6、TNF是輔助性T細胞中介導炎癥免疫應答的Th1細胞分泌的促炎細胞因子，富集分析顯示T細胞受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路是童心康合劑治療病毒性心肌炎的可能途徑；T細胞受體在免疫突觸形成中發揮著關鍵的作用，提供了T細胞和抗原呈遞細胞之間的連接，T細胞激活促進了信號級聯，通過調節細胞因子產生，細胞存活、增殖和分化決定細胞命運。有研究顯示，IL-6單克隆抗體通過抑制Th17、Treg細胞數量和功能，實現對自身免疫性心肌炎的保護作用[7]。CD40信號與TNF受體相關因子結合，在動脈粥樣硬化形成中發揮著重要作用[8]。

綜上所述，抑制免疫反應是童心康合劑治療病毒性心肌炎的可能機制。網絡藥理學提示童心康合劑可抗流感病毒A，抑制細胞凋亡，可見童心康合劑治療病毒性心肌炎是多途徑、多靶點的，體現了中醫藥治療的優勢，為進一步探討童心康合劑治療小兒病毒性心肌炎的分子機制提供了思路。