基于SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路探討丹皮酚對急性心肌梗死模型大鼠的治療作用

徐 明，侯 靜，趙麗娜

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是高發病率和高致死率的心血管疾病，因心肌缺血引起多種活性氧物質生成增加，誘導體內氧化應激反應發生，并啟動多種炎性因子、趨化因子大量表達，造成心肌細胞損傷及凋亡，臨床表現為持久劇烈的胸骨后疼痛及心肌酶活性增高，并常伴有心律失常，威脅病人生命安全[1-3]。AMI進展過程中，沉默信息調節因子3(silent information regulator 3，SIRT3)/β-連環蛋白(β-catenin)/過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)信號通路在調節氧化應激和炎性因子水平、保護心肌細胞和血管內皮細胞方面具有重要的作用[4]。丹皮酚是中藥牡丹皮中主要的酚酸類有效成分，具有改善血管內皮功能、保護心肌細胞及抗炎、抗心律失常等藥理作用[5]，但丹皮酚與SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路的關系尚未明確。本研究通過建立AMI大鼠模型，觀察丹皮酚對大鼠AMI后的保護作用，基于SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路探討其作用機制，以期為臨床治療AMI的用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠60只，體質量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物合格證號：202010208；動物許可證號：SCXK(京)2020-2-006；動物批號：202010108。

1.1.2 實驗藥品與試劑 丹皮酚注射液(批號：20190603)購自寧波天真制藥有限公司；RIPA裂解液及二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；卡托普利(批號：180102)購自江蘇平光制藥有限公司；白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒購自武漢EIAAb公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSP-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔源β-actin抗體、兔抗SIRT3一抗、β-catenin抗體、兔抗PPARγ一抗及HRP標記山羊抗兔IgG二抗購自美國Abbiotec公司。

1.1.3 實驗儀器 VisualSonics Vevo770 型動物心臟超聲儀購自美國GE公司；AU2700 全自動生物化學分析儀購自日本奧林巴斯公司；SW1022-ProfiBlot 48型全自動蛋白印跡分析儀購自Bioneer公司；IX73倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯光學有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 AMI模型大鼠的建立 參照相關文獻[6]，采用左冠狀動脈前降支結扎法建立AMI模型：50只SD大鼠適應性喂養1周后，10%水合氯醛腹腔麻醉，氣管插管后連接呼吸機并監測心率，在左側第3肋間、第4肋間橫向切開皮膚1 cm左右，打開胸腔暴露心臟，采用4號縫合線在左冠狀動脈前降支起源2～3 mm處結扎；另設10只SD大鼠作為假手術組，只穿線不結扎。若此時心電圖提示胸導ST段弓背向上抬高、T波高聳及QRS波電壓增高伴波幅增寬提示結扎建模成功，之后將心臟送回胸腔并縫合胸壁，待大鼠生命體征穩定后再撤掉呼吸機，建模大鼠連續3 d腹腔注射青霉素鈉20×104U預防感染，每日1次。

1.2.2 實驗分組及給藥 將上述建模成功的SD大鼠采用隨機數字表法分為模型組、卡托普利組、丹皮酚低劑量組、丹皮酚中劑量和丹皮酚高劑量組，每組10只；另設10只健康雄性SD大鼠為對照組。建模成功后開始進行丹皮酚及陽性藥干預，連續2周，每日1次，依次給予4 mg/kg、8 mg/kg、16 mg/kg的丹皮酚和10 mg/kg的卡托普利灌胃；對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。末次給藥后次日，空腹12 h后進行相關指標測定。

1.2.3 心功能指標測定 末次給藥后次日采用多普勒超聲診斷儀測量大鼠左室功能。參照相關文獻[7]，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取仰臥位將大鼠固定在操作臺上，使用超聲心動儀及高頻探頭行超聲心動圖檢查，指標包括左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)和左室質量指數(LVMI)。

1.2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測大鼠心臟組織病理學變化 各組大鼠心功能檢測結束后，迅速分離冠狀動脈及左心室組織，參照相關文獻[8]進行HE染色：4%甲醛溶液固定24 h，二甲苯透明，石蠟包埋，蘇木素及伊紅染色，利用光學顯微鏡觀察心肌組織病理學改變，并進行圖像采集。

1.2.5 血清心肌損傷指標檢測 各組大鼠超聲心動圖檢測完成后，使用負壓管心尖穿刺法取血，血樣于4 ℃靜置20 min后，以2 000 r/min離心20 min，之后抽取上清，分裝后于-80 ℃保存待測。采用全自動生化分析儀檢測血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平及心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)水平[9]。

1.2.6 血清炎性因子水平測定 根據酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒說明書，檢測各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量[10]。每孔中加入10 μL樣品及40 μL樣本稀釋液，采用酶標儀于450 nm處測量吸光度并按照標準曲線計算IL-1β、IL-6、TNF-α濃度。

1.2.7 心肌組織氧化損傷指標測定 分離上述各組大鼠左心室梗死邊緣區心肌組織，參照相關文獻[11]制備心肌勻漿：勻漿器中，按照心肌質量/體積為1∶9加入預冷的生理鹽水，制備成10%心肌組織勻漿，以3 500 r/min 4 ℃離心20 min，之后取上清液，嚴格按照試劑盒說明書操作，采用ELISA檢測心肌組織MDA、SOD、GSP-Px水平。

1.2.8 心肌組織SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路蛋白的測定 分離上述各組大鼠左心室心肌組織，參照相關文獻[12]制備左心室心肌勻漿，RIPA裂解后提取心肌總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量。之后常規上樣、聚丙烯酰胺凝膠電泳，經轉膜、封閉，隨后依次加入兔源單克隆SIRT3(1∶500)、β-catenin(1∶500)、PPARγ(1∶500)、pAkt(1∶500)、GAPDH(1∶500)一抗及辣根過氧化物酶標志鼠抗兔二抗(1∶2 000)，化學底物發光法顯色，圖像掃描分析，采用Image-QuaNT軟件測量其光密度，以GAPDH為內參對照分析。

2 結 果

2.1 丹皮酚對AMI大鼠心功能的影響 與對照組比較，模型組、卡托普利組和丹皮酚各劑量組LVEF、LVFS降低(P<0.01)，LVMI增加(P<0.05)。與模型組比較，卡托普利組及丹皮酚中劑量組、丹皮酚高劑量組LVEF、LVFS增加(P<0.05或P<0.01)，LVMI降低(P<0.05)，且隨著丹皮酚劑量增加，大鼠LVEF、LVFS及LVMI改善明顯。丹皮酚低劑量組LVEF、LVFS較模型組增加(P<0.05)。詳見表1。

表1 丹皮酚對AMI大鼠心功能的影響(±s)

2.2 丹皮酚對AMI大鼠左室組織病理學的影響 對照組左室心肌組織心肌橫紋清晰，細胞排列整齊規則，無纖維斷裂及炎性細胞浸潤。模型組大鼠心肌組織可見心肌纖維腫脹斷裂，細胞排列紊亂，心肌間質可見大量炎性細胞浸潤，并出現明顯的心肌細胞壞死。與模型組比較，卡托普利組及丹皮酚高劑量組心肌細胞排列較整齊，心肌橫紋無明顯改變，心肌間質存在輕度炎性細胞浸潤；丹皮酚中劑量組可見少量心肌纖維腫脹，心肌細胞有炎性細胞浸潤，細胞呈輕度腫脹；丹皮酚低劑量組心肌細胞排列、心肌纖維腫脹及炎性細胞浸潤均有一定改善。詳見圖1。

圖1 各組大鼠左室組織病理學光鏡圖

2.3 丹皮酚對AMI大鼠血清心肌損傷指標的影響 與對照組比較，模型組、卡托普利組及丹皮酚各劑量組血清CK、CK-MB、LDH及cTnT、cTnI水平均增加(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，卡托普利組及丹皮酚各劑量組血清CK、CK-MB、LDH及cTnT、cTnI水平均降低(P<0.05或P<0.01)，且隨著丹皮酚劑量增加，大鼠體內CK、CK-MB、LDH及cTnT、cTnI水平逐漸降低。詳見表2。

表2 丹皮酚對AMI大鼠血清心肌損傷指標的影響(±s)

2.4 丹皮酚對AMI大鼠血清炎性因子水平的影響 與對照組比較，模型組、卡托普利組及丹皮酚各劑量組血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平均增加(P<0.01)。與模型組比較，卡托普利組及丹皮酚各劑量組血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平均降低(P<0.05或P<0.01)，且隨著丹皮酚劑量增加，大鼠體內血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平逐漸降低。詳見表3。

表3 丹皮酚對AMI大鼠血清炎性因子水平的影響(±s) 單位：ng/L

2.5 丹皮酚對AMI大鼠心肌組織氧化損傷指標的影響 與對照組比較，模型組、卡托普利組及丹皮酚各劑量組心肌SOD、GSP-Px水平均降低(P<0.05或P<0.01)，MDA增加(P<0.05)。與模型組比較，卡托普利組及丹皮酚中劑量組、丹皮酚高劑量組心肌SOD、GSP-Px水平均增加(P<0.01)，MDA降低(P<0.05)，且隨著丹皮酚劑量增加，大鼠SOD、GSP-Px及MDA水平明顯改善。丹皮酚低劑量組GSP-Px水平較模型組增加(P<0.05)。詳見表4。

表4 丹皮酚對AMI大鼠心肌組織氧化損傷指標的影響(±s)

2.6 丹皮酚對AMI大鼠心肌組織SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路的影響 與對照組比較，模型組、卡托普利組及丹皮酚各劑量組心肌SIRT3、β-catenin及PPARγ相對表達量均增加(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，卡托普利組及丹皮酚中劑量組、丹皮酚高劑量組心肌SIRT3和β-catenin相對表達量均增加(P<0.05)，PPARγ相對表達量均降低(P<0.05)，且隨著丹皮酚劑量變化，大鼠SIRT3、β-catenin及PPARγ表達量變化量越明顯。詳見表5。

表5 丹皮酚對AMI大鼠心肌組織SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路蛋白的影響(±s)

3 討 論

AMI多由動脈粥樣硬化斑塊脫落聚集形成血栓，冠狀動脈血流中斷所致，進而引起心肌缺血缺氧，心功能受損[13]。中藥作為我國特有的醫藥寶庫，從中尋找可有效抑制AMI后心肌組織損傷的藥物意義重大。丹皮酚作為傳統中藥牡丹皮的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、改善心血管疾病等藥理作用[14]。本研究結果顯示，AMI模型大鼠經丹皮酚干預后LVEF、LVFS增加，LVMI降低，提示丹皮酚可改善左室收縮功能和心肌收縮力，提高心排血量，與相關報道[15]一致；組織形態學證實丹皮酚對心肌的保護作用，丹皮酚干預可減輕心肌細胞炎癥浸潤及水腫，抑制AMI模型大鼠心肌病理性改變。CK、CK-MB、LDH及cTnT、cTnI作為心肌損傷敏感的生物標志物，心肌發生缺血損傷時，血液中上述特異性心肌酶升高[16]，經丹皮酚干預后，AMI模型大鼠CK、CK-MB、LDH及cTnT、cTnI水平均減低，提示丹皮酚具有心臟保護作用，可對抗AMI所致心臟損傷。

AMI后心肌損傷與氧化應激反應和炎癥反應引起的心肌細胞凋亡密切相關。心肌梗死發生時，心肌線粒體氧自由基損傷產生大量脂質過氧化反應產物MDA，并不斷消耗胞漿SOD、GSH-Px等抗氧化酶，伴隨大量IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子產生，因此，治療AMI的關鍵環節是抑制氧化應激和炎癥反應[17-18]。為揭示丹皮酚對AMI大鼠的保護作用機制，本研究檢測了血清氧化應激指標、炎性因子變化情況，結果顯示，AMI模型大鼠經丹皮酚干預后血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平均減低，心肌SOD、GSP-Px水平均增加、MDA降低，證明丹皮酚通過提高SOD、GSH-PX及降低MDA水平，減輕AMI過程中氧化應激誘發的心肌損傷，同時降低炎性因子水平，緩解AMI進程。

SIRT3作為一種去乙酰化酶，與心肌肥厚和心肌梗死關系密切，SIRT3基因敲除后心血管平滑肌增殖加快，導致動脈粥樣硬化及AMI發生[19]。SIRT3與β-catenin相互調控促進心肌成纖維細胞轉化，并與PPARγ核受體結合參與糖脂代謝、炎癥反應、脂肪細胞分化等多種生命活動，且抑制PPARγ，激活SIRT3/β-catenin表達，可能有益于改善動脈粥樣硬化中的炎癥反應[20]。有研究顯示，調節SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路可改善AMI大鼠心室重構，降低炎癥反應，發揮心肌保護作用[4]。本研究中，AMI模型大鼠經丹皮酚干預后心肌SIRT3及β-catenin相對表達量均增加，PPARγ相對表達量均降低，表明AMI大鼠給予丹皮酚干預后可下調PPARγ，激活SIRT3及β-catenin表達，減輕AMI大鼠體內炎癥反應，從而保護心肌細胞。

綜上所述，丹皮酚可改善AMI大鼠心功能，抑制氧化應激及炎癥反應，其作用可能與調控心肌組織SIRT3/β-catenin/PPARγ通路活性有關。