基于Rock2信號(hào)通路探討黃芩苷對(duì)阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

黃 燕，駱飛飛，唐 卉，周 嬙，徐朝義

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種發(fā)病隱匿、病情緩慢漸進(jìn)加劇的神經(jīng)退行性疾病。有統(tǒng)計(jì)顯示，2010年全球AD病人達(dá)3 600萬例，且預(yù)計(jì)2030年將達(dá)到6 570萬例[1]。AD特征性的病理改變?yōu)棣?淀粉樣蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)積聚形成斑塊沉淀、Tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)。臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)能力逐漸降低，記憶力逐漸衰退，伴隨逐漸加重的思維、語言、精神障礙，病人最終喪失生活自理能力[2-3]。這些不僅嚴(yán)重降低了病人生活質(zhì)量，而且給家庭與社會(huì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)。臨床常見的AD多為散發(fā)性，與遺傳基因突變關(guān)系較少[4]，因此，發(fā)病機(jī)制尚不明確，且無特效治療藥。

現(xiàn)階段AD臨床治療常用藥物為乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase，AchE)抑制劑和N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體拮抗劑，然而這些藥物對(duì)部分病人有效，且無法改善癡呆樣癥狀[5]。尋找療效顯著且具有預(yù)防作用的治療藥物是今后AD的研究方向。中藥黃芩及主要成分黃芩苷在相關(guān)研究中發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用，相關(guān)機(jī)制包括抗氧化、抗炎、抗谷氨酸興奮性毒性和促進(jìn)神經(jīng)元再生[6]。現(xiàn)階段關(guān)于黃芩苷治療AD的研究較少。本研究構(gòu)建AD模型淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)及早老素-1(presenilin-1，PS1)雙轉(zhuǎn)基因小鼠，探究黃芩苷對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能和Aβ蛋白的沉積的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 黃芩苷(baicalin，BA，西安開來生物公司)；溶血磷脂酸(lysobisphosphatidic acids，LPA，美國Sigma公司)；生理鹽水(四川科倫醫(yī)藥公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco生物公司)；孕馬血清、胎牛血清(內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司)；噻唑藍(lán)(北京索萊寶生物公司)；兔源Anti-Aβ多克隆抗體、鼠源Anti-Rock2單克隆抗體、兔源(美國CST公司)；鼠源Anti-Caspase-3單克隆抗體、鼠源Anti-Bcl-2單克隆抗體、兔源Anti-Bax多克隆抗體，兔源Anti-β-actin多克隆抗體(美國Proteintech公司)；堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)、Alexa Fluor標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(H+L)、HRP標(biāo)記山羊抗兔/鼠IgG(H+L)(美國CST公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 8月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因C57BL/6雄性小鼠(16只)與8月齡野生型C57BL/6雄性小鼠(8只)，無特定病原體(SPF)級(jí)，體質(zhì)量(33±2)g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。所有動(dòng)物飼養(yǎng)條件為正常且充足的攝食飲水，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照，溫度(24±1)℃，相對(duì)濕度(65±5)%。將APP/PS1小鼠分為模型組與黃芩苷組，將野生型C57BL/6小鼠作為對(duì)照組。所有動(dòng)物分籠后適應(yīng)環(huán)境喂養(yǎng)1周。黃芩苷組小鼠連續(xù)28 d灌胃給藥黃芩苷溶液，劑量為60mg/kg，每日1次，另外兩組給予相同體積生理鹽水灌胃。

1.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力 水迷宮系統(tǒng)分為測(cè)試水箱、攝像頭、電腦分析系統(tǒng)。測(cè)試水箱為一個(gè)高0.6 m、直徑1.2 m圓柱體，水箱中注入高約0.4 m自來水，設(shè)置水迷宮恒溫系統(tǒng)控制水溫為(24±1)℃。攝像頭記錄水面，電腦分析系統(tǒng)將水面分為4個(gè)象限、靶象限、對(duì)側(cè)象限。左側(cè)象限和右側(cè)象限。靶象限中設(shè)置一個(gè)低于水面約1 cm的圓形平臺(tái)，供小鼠逃生使用，水箱四周貼有不同形狀的圖形，提供小鼠記憶空間信息。整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練階段與測(cè)試階段，訓(xùn)練階段共5 d，每日自各個(gè)象限丟入水中，記錄小鼠120 s內(nèi)尋找并登上平臺(tái)時(shí)間。若小鼠120 s內(nèi)無法登上平臺(tái)，引導(dǎo)至平臺(tái)并記錄逃避潛伏期為120 s。測(cè)試期間，撤去逃生平臺(tái)，將小鼠自對(duì)側(cè)象限丟入水中，自由尋找平臺(tái)，記錄小鼠首次達(dá)到平臺(tái)象限所用時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)與靶象限停留時(shí)間。

1.4 電生理長時(shí)程電位記錄 小鼠麻醉后，腦部固定于立體定位儀上。頂部備皮消毒，打開皮膚，暴露顱骨，以前囟為零點(diǎn)，確定刺激電極，記錄電極位置。刺激電極：前囟后2.8 mm，中線左側(cè)旁開0.4 mm，深度2.5 mm。記錄電極：前囟后2.8 mm，中線右側(cè)旁開0.4 mm，深度2.5 mm。插入電極后，每10 s給予1次的脈沖刺激，調(diào)整刺激電極和記錄電極的位置和深度，直到出現(xiàn)最佳的場(chǎng)興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)波形，固定刺激電極和記錄電極。不斷改變刺激強(qiáng)度，以引起最大反應(yīng)50%～70%的電流強(qiáng)度為最佳刺激強(qiáng)度。每10 s給予1次單脈沖刺激并記錄基線，基線穩(wěn)定記錄10 min后，使用高頻刺激誘發(fā)長時(shí)程增強(qiáng)(long time potentiation，LTP)，連續(xù)20串高頻脈沖，每串包含200個(gè)脈沖，頻率為200 Hz，波寬200 μs，串間隔30 s，高頻刺激連續(xù)記錄1 h。

1.5 免疫組化檢測(cè)Aβ沉積 將小鼠置于通風(fēng)櫥內(nèi)，打開胸腔，暴露心臟，自左心室插入注射針頭，注入生理鹽水，剪開右心耳沖出血液，待沖出液體無血色，序貫4%多聚甲醛固定液，結(jié)束后取全腦置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜。次日取全腦組織置入梯度乙醇溶液中脫水，待全腦表面乙醇揮發(fā)，使用二甲苯乙醇溶液透化，再使用石蠟包埋后切片，厚度約40 μm。將海馬區(qū)較完整的腦片取出，100 ℃烘箱中烘烤15 min修復(fù)抗原，再將腦片置于4%胎牛血清封閉液中封閉2 h，清洗切片，加入兔源Anti-Aβ抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜。隔日取出切片，PBST清洗并加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)抗體稀釋液，4 ℃條件下避光孵育2 h。反應(yīng)結(jié)束后，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗二抗稀釋液，DAB顯色30 s，沖洗DAB后再次使用蘇木精復(fù)染20 s，蒸餾水分化，在不同梯度乙醇中脫水，二甲苯透化樣品，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察拍片。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與分組給藥 PC12細(xì)胞株購自南京科佰生物技術(shù)公司，使用培養(yǎng)體系為DMEM高糖培養(yǎng)基加入10%孕馬血清、5%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素。培養(yǎng)溫度為37 ℃，通入5%CO2混合氣體。待細(xì)胞瓶中細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，使用0.25胰蛋白酶消化1 min，吹下細(xì)胞，加入6孔板、24孔板或96孔板中。將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、黃芩苷組和黃芩苷+溶血磷酸酯組(黃芩苷+LPA組)。待96孔板中細(xì)胞生長至80%融合，吸出培養(yǎng)基后PBS清洗，各組預(yù)加入含198 μL培養(yǎng)基、200 μmol/L黃芩苷或200 μmol/L黃芩苷+40 μmol/L LPA。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，各組(除對(duì)照組)加入2 μL 3 mmol/L Aβ25-35(終濃度為30 μmol/L)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行噻唑藍(lán)(thiazolylblue，MTT)測(cè)試或其他實(shí)驗(yàn)研究。

1.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rock2表達(dá) 各組PC12細(xì)胞接種于24孔板中，待生長至80%融合，給藥孵育24 h。使用4%正常胎牛血清封閉2 h。PBST洗去封閉液，加入鼠源Anti-Rock2抗體(1∶100)，4 ℃條件，濕盒中孵育過夜。次日，PBST洗去封閉液，加入Alexa Fluor標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(H+L)溶液(1∶100)，4 ℃條件下孵育2 h。PBST洗去二抗溶液，加入DAPI稀釋液染核，再加入抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍片。

1.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)

1.8.1 小鼠腦組織蛋白提取 各組小鼠迅速斷頭取腦，鑷子取出海馬組織，加入組織蛋白裂解液，研磨成細(xì)胞懸液。4 ℃冰箱中靜置20 min使蛋白完全裂解，12 000 r/min條件下離心20 min。檢測(cè)上清液蛋白濃度，使用組織蛋白裂解液稀釋到相同濃度，加入上樣緩沖液。

1.8.2 PC12細(xì)胞蛋白提取 各組PC12細(xì)胞接種于6孔板中，待生長至80%融合，給藥孵育24 h。各組樣品孔中細(xì)胞采用胰酶消化并用PBS洗滌3遍，加入100 μL組織蛋白裂解液，震蕩混懸20 min，靜置20 min，全程維持4 ℃環(huán)境溫度。吸取上清液檢測(cè)蛋白濃度，各組加入不同體積組織蛋白裂解液稀釋至相同濃度，并加入上樣緩沖液。

1.8.3 十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠電泳 配制不同濃度的分離膠與濃縮膠，拔出上樣梳，每個(gè)載樣孔中加入10 μL樣品。設(shè)置電泳電壓：60 V，30 min；120 V，60 min，整個(gè)電泳過程以上樣緩沖液達(dá)到底部為終點(diǎn)。根據(jù)分子質(zhì)量標(biāo)記物截取目標(biāo)蛋白條帶，使用濕法轉(zhuǎn)膜法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，設(shè)置轉(zhuǎn)膜電流為恒流：2 mA，60 min，以上所有過程保持冰浴。取出PVDF膜，以4%胎牛血清封閉，采用目的蛋白一抗稀釋液孵育PVDF膜過夜。次日，取出PVDF膜，洗凈一抗稀釋液，使用二抗稀釋液避光孵育2 h。洗凈二抗后，將超敏發(fā)光液滴加于PVDF膜上，顯影儀下顯影獲得目的蛋白條帶。所有條帶以β-actin條帶表達(dá)灰度值進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩苷對(duì)APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)與記憶功能的影響 采用Morris水迷宮觀察黃芩苷對(duì)APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)與記憶功能的影響。訓(xùn)練首日，多數(shù)小鼠無法在測(cè)試時(shí)間內(nèi)登上逃生平臺(tái)，表現(xiàn)為在水中漫無目的的游動(dòng)狀態(tài)，各組間逃避潛伏期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。訓(xùn)練第2天，由于小鼠基因類型不同，與野生型小鼠比較，模型組和黃芩苷組小鼠逃避潛伏期延長(P<0.05)。訓(xùn)練第3天開始，由于黃芩苷長期的干預(yù)，黃芩苷組小鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)。水迷宮測(cè)試階段，與模型組比較，黃芩苷組縮短了APP/PS1小鼠逃避潛伏期(P<0.05)，增加了小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)與靶象限停留時(shí)間(P<0.05)。詳見圖1、表1和表2。

圖1 各組小鼠水迷宮訓(xùn)練期間逃避潛伏期

表1 各組小鼠水迷宮訓(xùn)練期間逃避潛伏期比較(±s) 單位：s

表2 各組小鼠水迷宮測(cè)試期間相關(guān)指標(biāo)比較(±s)

2.2 黃芩苷對(duì)APP/PS1小鼠腦中長時(shí)程電位的影響 檢測(cè)海馬組織電生理興奮性突觸后電位明確黃芩苷對(duì)APP/PS1小鼠長時(shí)程電位的影響。與對(duì)照組比較，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠長時(shí)程電位抑制(P<0.05)；與模型組比較，黃芩苷長期給藥提高了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠長時(shí)程電位(P<0.05)。詳見圖2。

與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，＊P<0.05。

2.3 黃芩苷對(duì)APP/PS1小鼠海馬組織Aβ沉積的影響 采用免疫組化測(cè)定黃芩苷對(duì)APP/PS1小鼠海馬區(qū)Aβ沉積的影響。對(duì)照組未檢測(cè)出Aβ沉積斑塊。模型組小鼠可檢測(cè)出顏色較深、面積較大的Aβ沉積斑塊。與模型組比較，黃芩苷長期給藥有效減小了小鼠海馬組織中Aβ沉積斑塊面積，且Aβ沉積斑塊染色較淺。詳見圖3。

圖3 各組小鼠海馬區(qū)Aβ斑塊免疫組化圖像

2.4 黃芩苷對(duì)APP/PS1小鼠海馬組織Rock2、Caspase-3、Bcl-2與Bax的影響 采用Western Blot檢測(cè)了黃芩苷對(duì)小鼠海馬組織各蛋白的影響。野生型小鼠海馬組織Rock2與Cleaved-Caspase-3低表達(dá)，且Bcl-2/Bax表達(dá)比例較高。與對(duì)照組比較，APP/PS1小鼠腦組織Rock2與Cleaved-Caspase-3表達(dá)增加(P<0.05)，Bcl-2/Bax表達(dá)比例降低(P<0.05)。黃芩苷長期給藥降低了小鼠海馬組織Rock2與Cleaved-Caspase-3表達(dá)水平(P<0.05)，升高Bcl-2/Bax表達(dá)比例(P<0.05)。詳見圖4。

與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，＊P<0.05。

2.5 黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響 體外實(shí)驗(yàn)首先觀察不同濃度Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響。不同濃度Aβ25-35呈劑量依賴性降低PC12細(xì)胞存活率。Aβ25-35劑量達(dá)到30 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率下降至約70%；Aβ25-35劑量達(dá)到40 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率下降至約40%。考慮到細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)需要一定活率基礎(chǔ)，本研究使用Aβ25-35劑量為30 μmol/L。詳見圖5。黃芩苷干預(yù)下，PC12細(xì)胞存活率呈劑量依賴性升高，與模型組比較，黃芩苷200 μmol/L介導(dǎo)PC12細(xì)胞存活率增加(P<0.05)。黃芩苷與Rock2激動(dòng)劑LPA共同干預(yù)降低了PC12細(xì)胞存活率(P<0.05)。詳見圖6。

與對(duì)照組比較，#P<0.05。

與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，＊P<0.05。

2.6 黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中Rock2表達(dá)的影響 免疫熒光實(shí)驗(yàn)樣品處理中，PC12細(xì)胞使用黃芩苷200 μmol/L或黃芩苷200 μmol/L +LPA 40 μmol/L預(yù)干預(yù)，2 h后，各組再加入Aβ25-3530 μmol/L造模。與對(duì)照組比較，PC12細(xì)胞中Rock2表達(dá)增加(P<0.05)；與模型組比較，黃芩苷降低了PC12細(xì)胞中Rock2表達(dá)(P<0.05)。黃芩苷與LPA聯(lián)合使用，PC12細(xì)胞中Rock2表達(dá)再次增加。詳見圖7。

與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，＊P<0.05。

2.7 黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組PC12細(xì)胞中Cleaved-Caspase-3表達(dá)增加(P<0.05)，Bcl-2/Bax表達(dá)比例降低(P<0.05)。與模型組比較，黃芩苷干預(yù)降低了Cleaved-Caspase-3表達(dá)水平(P<0.05)，升高了Bcl-2/Bax表達(dá)比例(P<0.05)。LPA共同干預(yù)逆轉(zhuǎn)了黃芩苷介導(dǎo)的Cleaved-Caspase-3表達(dá)降低，Bcl-2/Bax表達(dá)比例提高。詳見圖8。

與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，＊P<0.05。

3 討 論

AD是一種好發(fā)于老年人群的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，常伴有癡呆樣癥狀。本研究使用動(dòng)物為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，是將外源性APP/PS1基因通過基因重組技術(shù)整合到小鼠基因組中構(gòu)建雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型[7]。該品系小鼠腦組織較早出現(xiàn)與AD病理相似的Aβ蛋白沉積，Aβ是造成大腦神經(jīng)毒性的主要原因，引起小鼠腦內(nèi)炎癥和學(xué)習(xí)記憶能力下降，因此，該品系小鼠常作為AD模型用于研究。Morris水迷宮是現(xiàn)階段常用于測(cè)定學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能的手段，原理是通過逃避潛伏期的縮短程度判斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)能力，穿越平臺(tái)次數(shù)與靶象限停留時(shí)間反映大鼠空間記憶能力[8]。神經(jīng)系統(tǒng)中的興奮傳遞是通過神經(jīng)元之間突觸建立的，在神經(jīng)退行性疾病發(fā)生時(shí)突觸興奮傳遞效率降低。LTP是神經(jīng)元之間興奮性突觸后電位的斜率變化，可準(zhǔn)確反映突觸之間興奮傳遞的效率，是判斷突觸可塑性與機(jī)體學(xué)習(xí)與記憶能力的指標(biāo)之一。有研究顯示，神經(jīng)退行性疾病造成的癡呆樣癥狀伴有LTP抑制的現(xiàn)象[9]。本研究中綜合水迷宮和LTP電位檢測(cè)顯示，APP/PS1小鼠出現(xiàn)了癡呆樣癥狀，學(xué)習(xí)記憶能力降低，突觸之間興奮傳遞與突觸可塑性降低。黃芩苷長期干預(yù)能顯著逆轉(zhuǎn)小鼠癡呆樣癥狀。

大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12細(xì)胞是一種類神經(jīng)元細(xì)胞，現(xiàn)階段廣泛應(yīng)用于體外神經(jīng)系統(tǒng)的研究。Aβ作為AD腦組織中毒性肽之一，是AD病人病情加劇的重要病理標(biāo)志物[10]。研究報(bào)道顯示，腦室注射Aβ25-35造成小鼠出現(xiàn)類似AD癡呆樣、學(xué)習(xí)記憶功能障礙、突觸傳遞抑制等癥狀，同時(shí)導(dǎo)致海馬組織內(nèi)神經(jīng)炎癥與神經(jīng)元凋亡[11]。體外研究中，應(yīng)用Aβ25-35干預(yù)神經(jīng)元細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，APP/PS1小鼠腦組織中出現(xiàn)大量Aβ蛋白沉積，且凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase-3與Bax表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低。體外實(shí)驗(yàn)中，Aβ25-35作用于PC12細(xì)胞系造成神經(jīng)元凋亡，Aβ25-35劑量越高，細(xì)胞毒性越大，細(xì)胞存活率越低。Aβ25-35導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase-3表達(dá)增加，而Bcl-2/Bax表達(dá)降低。本研究結(jié)果提示，體外實(shí)驗(yàn)中APP/PS1小鼠出現(xiàn)了與臨床相似的癡呆樣、學(xué)習(xí)記憶功能障礙癥狀。體外實(shí)驗(yàn)中，Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡反映了小鼠腦組織中Aβ沉積造成的神經(jīng)元死亡，即本研究中體內(nèi)、體外AD模型建模成功。

黃芩苷是從黃芩根莖中提取分離出的一種黃酮類化合物。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃芩性苦、味寒，可清熱解郁、調(diào)節(jié)情志，是中醫(yī)治療氣血不暢的常用藥物之一。現(xiàn)代研究認(rèn)為，黃芩苷具有抗炎、抗氧化的生物活性，可穿過血腦屏障發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[13]。在缺血性腦卒中的研究中，黃芩苷預(yù)給藥通過增加血管周圍Claudin-5蛋白表達(dá)，保護(hù)血腦屏障完整性，降低水通道蛋白1(AQP1)核酸含量，從而減輕缺血性腦水腫程度，改善腦缺血再灌注造成的神經(jīng)功能損傷[14]。在抑郁癥的研究中，黃芩苷長期給藥通過抑制Toll樣受體4(TLR4)蛋白表達(dá)，抑制腦組織炎性細(xì)胞因子釋放，改善海馬組織微環(huán)境，提高神經(jīng)元再生，從而逆轉(zhuǎn)長期慢性不可預(yù)知性應(yīng)激造成的抑郁樣行為[15]。Rock在各種疾病(包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病)的治療中發(fā)揮著重要作用[16]。Rock有2個(gè)同種型，即Rock1和Rock2。Rock2主要在大腦和肌肉中表達(dá)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中軸突變性、神經(jīng)元死亡和軸突再生的主要調(diào)節(jié)劑。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷通過抑制Rock2蛋白表達(dá)，降低Cleaved-Caspase-3表達(dá)，逆轉(zhuǎn)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中Aβ蛋白沉積，提高小鼠長時(shí)程電位，改善小鼠學(xué)習(xí)與記憶功能。體外實(shí)驗(yàn)中，黃芩苷干預(yù)通過抑制Rock2表達(dá)，提高了Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率。LPA是Rock2激動(dòng)劑，造成小鼠海馬組織出現(xiàn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。本研究中，LPA與黃芩苷共同干預(yù)上調(diào)了Rock2表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了黃芩苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞存活率的改善作用。提示黃芩苷通過抑制Rock2相關(guān)信號(hào)通路改善神經(jīng)元凋亡。

綜合本研究結(jié)果，黃芩苷在AD的預(yù)防和治療中具有顯著療效。基于黃芩苷低毒性質(zhì)，高發(fā)AD的老年人群可嘗試飲用黃芩作為AD預(yù)防方式。黃芩苷治療AD的作用機(jī)制為抑制Rock2相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡，抑制Aβ蛋白沉積并提高長時(shí)程電位水平，最終發(fā)揮改善學(xué)習(xí)與記憶功能。