長鏈非編碼RNA SPINT1-AS1抑制三陰性乳腺癌細胞增殖和促進凋亡的研究

劉春汕 杜坤朋 王栢耀 劉威 田允鴻

廣州醫科大學附屬腫瘤醫院放療科（廣州 510095）

2020年世界衛生組織國際癌癥研究機構發布的數據顯示，乳腺癌已成為全球發病率最高的癌癥［1］。根據表達受體分類，乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B 型、表皮生長因子受體-2（epidermal growth factor receptor 2，Her-2）過表達型以及TNBC 4 種類型［2-3］。在乳腺癌分型中，TNBC 是最為兇險的一種類型，其發病率大約占乳腺癌的15%～20%，生長迅速，惡性程度高。且因為TNBC 不表達雌激素受體、孕激素受體以及Her-2，因此缺乏經典的治療靶點，目前尚無較好的針對性治療方案［4-5］，所以探索新的治療靶點對TNBC 是至關重要的。

lncRNA 是存在于真核生物中的一類由大于200 個核苷酸組成，以不編碼蛋白為特征的RNA 分子，其具有腫瘤類型特異性［6-7］。研究表明lncRNA參與調節生物體內多種生物學過程，與人類疾病發生發展息息相關［8-9］。隨著研究的深入，越來越多的證據表明多種lncRNA 可能成為TNBC 發生發展過程中關鍵的治療靶點與預后生物標記物［10-12］。SPINT1-AS1 又名絲氨酸肽酶抑制劑Kunitz 1 型反義RNA 1，是位于15q15.1 染色體上，長度為632nt的lncRNA。目前對其研究較少，僅在宮頸癌、結直腸癌中報道SPINT1-AS1 高表達與不良預后有關［13-14］。但在食管鱗癌、腎母細胞癌中SPINT1-AS1 高表達與良好預后有關［15-16］。并且僅有1 篇文章報道SPINT1-AS1 在乳腺癌中促進其增殖轉移［17］，該文章并沒有對乳腺癌特定分子亞型進行闡述。TNBC 作為預后最差的乳腺癌亞型仍缺乏有效的治療靶點，因此本研究擬探索lncRNA 是否可以作為TNBC 的治療靶點。鑒于本課題組在前期的TNBC 細胞測序數據中發現SPINT1-AS1 在經典的抑癌分子miR-200c 過表達組的水平顯著高于空載對照組，由此筆者猜測SPINT1-AS1 可能也具有抑癌作用。因此，本研究擬在TNBC 中探索SPINT1-AS1 的功能作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養MCF-10A、MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-468 細胞均購自中國科學院細胞庫，MCF-10A 使用MCF-10A 完全培養基（賽庫生物公司）培養，其余細胞株使用含有10%FBS 的1640（Gibco 公司）培養，均在37 ℃含5%CO2的恒溫培養箱內生長。

1.2 qRT-PCR 實驗使用Trizol 裂解，氯仿提取，氯丙醇沉淀，含DEPC 水的75%酒精洗滌總RNA，將RNA 逆轉錄為cDNA，進行PCR 擴增。最后使用2-ΔΔCt法計算SPINT1-AS1 的表達量。

1.3 熒光原位雜交實驗將MDA-MB-231與BT549細胞接種至放有細胞爬片的24 孔板中，待細胞長至80%進行實驗。按照熒光原位雜交試劑盒（吉瑪公司）說明書進行，PBS 清洗，4%多聚甲醛固定后PBS 清洗。0.1%Triton X-100 打孔，PBS 清洗。SPINT1-AS1 探針加入雜交緩沖液中，混勻，73 ℃變性5 min，變性結束37 ℃孵育細胞過夜。12 h 后PBS清洗，使用DAPI染細胞核，室溫15 min后清洗。最后用抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡拍攝。

1.4 包裝shSPINT1-AS1 病毒shSPINT1-AS1#1與shSPINT1-AS1#2 質粒由擎科生物公司合成。病毒包裝質粒以及包膜蛋白質粒由中山大學附屬第一醫院生命科學實驗室惠贈。將293T 細胞加入預先用多聚賴氨酸包被的10 cm 皿中。待細胞長至80%使用PEI 試劑轉染，按照包裝質粒：包膜蛋白質粒：目的基因=4∶3∶1 的比例把3 者混合。取500 μL opti-MEM 稀釋混合質粒。將500 μL opti-MEM 稀釋60 μg 的PEI。隨后把PEI 稀釋液加入混合質粒稀釋液中，混勻靜置15 min。隨后將混合液緩緩加入293T 細胞。18 h 使用完全培養基取代含混合物的培養基，48 h 收集病毒液。收集的病毒液過濾之后可用于轉染細胞。

1.5 慢病毒轉染細胞實驗過表達SPINT1-AS1病毒由上海和元公司合成，shSPINT1-AS1#1 與shSPINT1-AS1#2 病毒自行包裝。MDA-MB-231 細胞鋪至24 孔板中，待細胞長至50%時開始轉染。分別使用500 μL opti-MEM 稀釋10 μL 對照組以及實驗組病毒液，將含1 μL/mL polybrene 的opti-MEM分別添加500 μL 至已混有病毒的對照與實驗管中，混勻靜置20 min。靜置結束將混合液置換原來的培養基。24 h 時使用完全培養基替換混合液，隨后使用嘌呤與G418 篩選得到穩定過表達與干擾SPINT1-AS1 的細胞株。

1.6 平板克隆形成實驗將穩轉株消化成單細胞懸液，接種于6 孔板中。細胞接種后使用完全培養基培養2 周左右終止培養。棄培養基后PBS 清洗，甲醇固定15 min后PBS清洗，結晶紫染色30 min，棄結晶紫，流水沖洗染料。最后用照相機拍攝圖片。使用image J計數，GraphPad prim7.0繪制計量圖。

1.7 CCK-8 檢測增殖活性按日本同仁公司的CCK-8 試劑盒說明書進行實驗，消化細胞接種于96孔板。分別在6、24、48、72、96 h時加入CCK-8 溶液，孵育1.5 h 后在酶標儀上450 nm 處檢測OD值。最后用GraphPad Prism 7.0 繪制折線圖。

1.8 Annexin V-APC/7-AAD流式細胞術測凋亡按照聯科生物凋亡試劑盒對細胞進行染色、孵育、過濾細胞團塊處理，隨后使用流式細胞儀檢測。最后使用Flow jo 軟件分析流式凋亡數據，Graph-Pad prim7.0 繪制凋亡計量圖。

1.9 統計學方法使用GraphPad Prism 7.0 軟件分析數據。計數數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析；配對樣本比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SPINT1-AS1 在正常乳腺上皮細胞及3 種TNBC 細胞中的表達為了研究SPINT1-AS1 在乳腺癌中的作用，本實驗首先比較其在正常乳腺上皮細胞以及TNBC 細胞中的表達情況。結果顯示，與正常乳腺上皮細胞MCF-10A 相比，在TNBC 細胞系MDA-MB-231、BT549 和MDA-MB-468 的SPINT1-AS1 的表達量均明顯降低（MDA-MB-468：t= 134.90，MDA-MB-231：t= 2 171.00，BT549：t=18 938.00，P＜0.000 1，圖1）。結果提示，SPINT1-AS1 可能在抑制TNBC 發生發展中起著重要作用。

圖1 qRT-PCR 檢測SPINT1-AS1 在細胞株間的表達Fig.1 qRT-PCR detects the expression of SPINT1-AS1 in various cell lines

2.2 SPINT1-AS1 在TNBC 細胞株的定位既往研究顯示，lncRNA 的功能與其表達位置存在相關性。為了研究lncRNA 的可能機制，本課題首先檢測了SPINT1-AS1 的細胞定位。見圖2，使用共聚焦顯微鏡探索SPINT1-AS1 在MDA-MB-231 以及BT549 細胞中的定位，發現SPINT1-AS1 主要表達于細胞質。說明SPINT1-AS1 作為一個lncRNA，主要是以轉錄后調控方式作用于細胞，具體調控機制有待進一步研究。

圖2 SPINT1-AS1 在MDA-MB-231 與BT549 細胞株的定位Fig.2 The localization of SPINT1-AS1 in MDA-MB-231 and BT549 cell lines

2.3 SPINT1-AS1 對TNBC 細胞增殖活性的影響為了研究SPINT1-AS1 對乳腺癌細胞株的影響，本實驗首先檢測SPINT1-AS1 不同表達水平細胞株之間的增殖能力差異。在MDA-MB-231 與BT549 細胞中過表達SPINT1-AS1，能顯著降低細胞克隆形成能力（MDA-MB-231：t= 64.00，BT549：t= 10.74，P＜0.01，圖3A）。在MDA-MB-231 細胞敲減SPINT1-AS1 后，與對照組相比，實驗組的克隆形成能力明顯增強（shSPINT1-AS1#1：t= 11.43，shSPINT1-AS1#2：t= 10.01，P＜0.01，圖3B）。進一步使用CCK-8 檢測SPINT1-AS1 對TNBC 增殖活性的影響。在MDA-MB-231 與BT549 細胞過表達SPINT1-AS1，能顯著降低細胞增殖能力（MDA-MB-231：96 h，t= 3.63，BT549：96 h，t= 4.30，P＜0.05，圖3C）。在MDA-MB-231 細胞干擾SPINT1-AS1 后，與對照組相比，增殖能力明顯增強（shSPINT1-AS1#1：t= 3.28，shSPINT1-AS1#2：t= 4.29，P＜0.05，圖3D）。總之，上述結果提示SPINT1-AS1 抑制TNBC細胞增殖。

圖3 過表達與敲低SPINT1-AS1 對TNBC 細胞株增殖的影響Fig.3 Effects of overexpression and knock-down of SPINT1-AS1 on the proliferation of TNBC cell lines

2.4 SPINT1-AS1 對TNBC 細胞凋亡的影響使用流式細胞儀檢測細胞凋亡，當在TNBC 細胞系中過表達SPINT1-AS1 時，實驗組細胞的總凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）高于對照組，在BT549細胞中表現尤為明顯（MDA-MB-231：t= 5.24，BT549：t= 10.19，P＜0.05，圖4A）。然而，當敲低SPINT1-AS1 時，實驗組的總凋亡率低于對照組（shSPINT1-AS1#1：t= 6.28，shSPINT1-AS1#2：t=9.70，P＜0.05，圖4B）。上述結果提示SPINT1-AS1能促進TNBC 凋亡。

圖4 過表達與敲低SPINT1-AS1 對TNBC 細胞株凋亡的影響Fig.4 Effects of overexpression and knock-down of SPINT1-AS1 on the apoptosis of TNBC cell lines

3 討論

乳腺癌是全球女性最常見的癌癥、也是導致死亡的重要原因之一［18-19］。與非TNBC 相比，TNBC具有高度異質性和更強侵襲性，因為其不表達雌激素受體、孕激素受體、Her-2 等標志物，所以目前缺乏靶向治療TNBC 的方法［20］。因此，探究針對TNBC 的新治療靶點尤為重要。既往研究顯示，lncRNA 可以參與調控TNBC 細胞增殖、凋亡、轉移等病理生理過程［21］。因此lncRNA 成為治療TNBC的潛在靶標。本實驗研究了lncRNA SPINT1-AS1在TNBC 中的作用，結果顯示SPINT1-AS1 能抑制TNBC 細胞增殖以及促進其凋亡。

SPINT1-AS1 是一種lncRNA。目前研究發現SPINT1-AS1 在不同癌癥發揮不同的功能，研究證明［13］SPINT1-AS1 抑制miR-214 進而激活Wnt/β-連環蛋白信號從而驅動宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲，驗證SPINT1-AS1 水平升高與宮頸癌患者預后不良有關。LI 等［14］在結直腸癌中發現SPINT1-AS1在癌組織的表達明顯高于癌旁組織，且發現高SPNT1-AS1 表達患者更易發生遠處轉移以及無復發生存期顯著縮短。然而，在食管鱗癌中SPINT1-AS1 的表達與癌旁組織相比明顯下調，并且通過生存曲線分析發現SPINT1-AS1 表達高的患者總體生存期更長［15］。同樣在一項透明細胞腎母細胞癌的研究中作者從數據庫篩選出9 個差異表達lncRNA，SPINT1-AS1 就是其中之一，通過LASSO運算、COX 回歸與生存分析得出SPINT1-AS1 表達高的患者預后更好的結論［16］。因此，在食管鱗癌、腎母細胞癌中高表達的SPINT1-AS1 與預后良好有關。不僅如此，高水平的SPINT1-AS1 可能使胃癌細胞NCL-N87 與乳腺癌細胞MCF-7 對拉帕替尼治療更敏感［22］。上述截然不同的研究結果證明SPINT1-AS1 所發揮功能是具有癌癥特異性的。在乳腺癌中，雖然ZHOU 等［17］已發表的研究中表明SPINT1-AS1 具有促進乳腺癌細胞增殖、遷移的作用。但本實驗通過qRT-PCR 檢測發現在乳腺正常細胞中SPINT1-AS1 的表達水平高于TNBC 細胞；進一步通過轉染病毒建立過表達與敲低SPINT1-AS1 穩轉株，當SPINT1-AS1 水平增加時，TNBC 細胞增殖能力顯著下降，凋亡顯著增加。當敲低SPINT1-AS1 時作用相反。總之，本研究通過一系列實驗發現SPINT1-AS1 可以顯著抑制TNBC 細胞的增殖并促進其凋亡。雖然本研究的結論與周等人的部分研究結論相反，但這可能與兩個研究采用不同的SPINT1-AS1 轉錄本有關。本研究是針對SPINT1-AS1 的第2 個轉錄本NR_146467.1 進行研究，而周的研究并未明確指出使用具體的轉錄本，這證明SPINT1-AS1 不僅具有腫瘤特異性，而且還可能具有轉錄本特異性。作為調控基因轉錄的lncRNA，SPINT1-AS1 可能通過不同的下游靶點來發揮不同的生物學效應。因此，SPINT1-AS1 在TNBC 的發生發展中的作用仍需要全方位、多維度、多組學的探索。已有許多研究報道［12］lncRNA在TNBC 的發生發展中發揮重要作用，例如lncRNA MIR503HG 抑制TNBC 細胞增殖以及促進其凋亡，作者從全方位、多維度，多組學驗證了MIR503HG通過miR-224-5p/HOXA9 軸抑制細胞增殖并促進TNBC 細胞凋亡。與本研究相同的是作者同樣使用CCK-8、克隆形成、流式細胞術檢測細胞增殖與凋亡，但作者不局限于此，不僅驗證了MIR503HG在體內同樣發揮抑癌功能，而且進一步通過生信分析、雙熒光素酶報告基因實驗等探索了lncRNA的下游機制，這是本實驗所缺少的，有待本課題組進一步完善。總之，本研究結果證明了SPINT1-AS1 能夠抑制TNBC 細胞的增殖并促進其凋亡。并且本研究確認了SPINT1-AS1 主要表達于TNBC細胞的細胞質，極大可能是通過轉錄后途徑參與細胞發生發展。

綜上所述，本實驗證實了SPINT1-AS1 抑制TNBC 細胞增殖以及促進其凋亡。當然，本研究還存在一些不足。首先本研究缺乏體內實驗來驗證SPINT1-AS1 對腫瘤生長、凋亡的作用，其次我們對SPINT1-AS1 在TNBC 細胞的抑癌作用的具體作用機制仍未闡明，我們初步的機制研究結果提示，SPINT1-AS1 主要定位于細胞質，極大可能是通過轉錄后途徑參與細胞發生發展。盡管仍需要通過測序或生信分析等方法進一步完善對SPINT1-AS1下游機制的探索，但是這樣的結果已經給出了重要的提示，SPINT1-AS1 可能成為治療TNBC 的一個新靶點，這為臨床治療TNBC 提供新方向。因此在今后的研究中，將繼續深入探索SPINT1-AS1 在TNBC 的作用機制。