microRNA-9-5p通過抑制Tau磷酸化參與阿爾茨海默病的機制

郝婧雯 鄧炎堯 謝君 萬奇

長沙市第一醫院神經內科（長沙 410000）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種以進行性記憶喪失和認知障礙為特征的神經退行性疾病，其特征是Tau 聚集體在大腦中沉積和認知缺陷［1-2］。細胞內過度磷酸化的Tau 蛋白是神經原纖維纏結的關鍵成分，導致神經元微管結構異常和軸突運輸功能障礙［3］。因此，通過上游靶信號的早期修飾治療抑制Tau 過度磷酸化可能是在預防AD 方面最有效的途徑。新出現的證據表明，microRNAs（miRNAs）參與AD 中的多個病理過程［4-5］。據推測，miRNA 靶向網絡的異常調節通過調節涉及Aβ 過度產生的基因、Tau 過度磷酸化、神經膠質激活誘導的神經炎癥、突觸功能障礙、和神經元凋亡在AD 病理過程中起關鍵作用［6-8］。microRNA-9-5p（miR-9-5p）可以抑制神經系統的細胞損傷。例如，miR-9-5p 通過靶向GSK-3β 抑制AD 細胞模型中的線粒體損傷和氧化應激［9］。然而，目前尚不清楚miR-9-5p 是否對AD中Tau 過度磷酸化產生影響。因此，本研究選擇APP/PS 小鼠模型作為研究對象，并分析miR-9-5p在小鼠海馬和血漿中表達情況，同時使用慢病毒（lentivirus，Lv）介導海馬中miR-9-5p 過度表達，并針對認知行為、突觸活動、Tau 磷酸化和DNA 損傷進行了表征。

1 材料與方法

1.1 動物分組和處理雄性APPswe/PS1dE9（APP/PS1）轉基因小鼠和WT C57BL/6（WT）同窩小鼠獲自南京大學模型動物研究中心。將APP/PS1 小鼠隨機分為3 組：Lv-WT 組、Lv-con 組和Lv-miR-9-5p組，每組18 只；WT 小鼠各隨機分為3 組：Lv-WT組、Lv-con 組和Lv-miR-9-5p 組，每組18 只。過表達miR-9-5p（Lv-miR-9-5p）和對照（Lv-con）的Lv 購自上海吉凱基因化學技術公司。將Lv-miR-9-5p（4×105轉導單位［TU］）或Lv-con（4×105TU）緩慢注射到6 個月大的APP/PS1 小鼠（Lv-miR-9-5p 組和Lv-con 組）的雙側海馬中（前后位置-2.0 mm，內側-外側位置±1.6 mm，背腹距前囟1.5 mm）。同時，將Lv-con（4 × 105TU）緩慢注射到6 個月大的WT 小鼠（Lv-WT 組）的雙側海馬中。注射后30 d進行行為測試或電生理實驗，然后處死小鼠進行其他實驗。

1.2 行為測試參照文獻方法［10］進行新物體識別（novel-object recognition，NOR）、恐懼狀態（fear condition，FC）和莫里斯水迷宮（Morris water maze，MWM）測試。（1）NOR：在NOR 試驗前24 h，將小鼠適應在一個30 cm 長×30 cm 寬×45 cm 高的非透明盒子中30 min。在訓練階段，向小鼠展示兩個新對象（對象1 和對象2），并允許其自由探索10 min。在測試階段，將其中一個對象（對象2）替換為一個新對象。讓小鼠探索這兩個物體5 min。使用視覺跟蹤系統記錄探索過程，并通過探索新物體的時間除以總時間計算辨別指數。（2）恐懼狀態測試：使用XR-XC404 條件反射室（上海欣軟信息科技有限公司）進行情境和線索恐懼條件測試。在訓練階段，將小鼠置于室內3 min，然后進行聲調電擊刺激，并在刺激后繼續在室內停留30 s。在試驗階段，在訓練后24 h 測量環境依賴性試驗，并允許小鼠在同一室內停留5 min。停止被定義為“除呼吸外無運動”，并使用跟蹤系統記錄停止時間。2 h 后，這些小鼠被帶到一個完全不同的新房間，持續3 min，并傳遞訓練音調，以檢查提示性恐懼條件反射。（3）MWM：進行MWM 測試以評估空間記憶功能。在采集試驗期間，小鼠在60 s 內接受連續5 d 的訓練，以找到隱藏在水下1 cm 處的平臺，并使用迷宮軟件記錄潛伏期（美國Stoelting公司）。在探針試驗期間，移除平臺，讓小鼠游泳1 min。然后記錄穿過平臺的次數、找到目標象限的潛伏期、在目標象限花費的時間、游泳速度和總距離。

1.3 微陣列和定量實時PCR分離海馬組織并使用組織勻漿器（武漢賽維爾生物科技有限公司）進行勻漿，使用RNeasy Mini Kit（德國QIAGEN 公司）或MiRNeasy Serum/Plasma Kit（德國QIAGEN 公司）提取和純化組織或血漿中的RNA。使用具有1 881 個獨特miRNA 探針的小鼠miRNA 微陣列（Release 21.0；數譜（上海）生物科技有限公司）分析miRNA 表達譜。篩選出APP/PS1 小鼠海馬中差異表達的miRNA（倍數變化＞2，調整P＜0.05）。使用TaqMan Advanced miRNA Assays（美國Thermo Fisher 公司）對miR-9-5p 表達進行定量。使用ABI 7500 PCR 儀器（美國Applied Biosystems 公司）進行反應。U6 小核RNA（snRNA）和cel-miR-39（美國Thermo Fisher 公司）分別用作組織和血漿的對照。用于實時PCR 的引物序列如下：miR-9-5p 正向：5'-GGGGTAGCACCATTTGAAA-3'，反向：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6 正向：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.4 電生理學參照文獻方法［11］制備海馬切片（300 μm）。將切片轉移至微電極陣列，連續灌注含氧人工腦脊液（ACSF）（2 mL/min），并保持在32 ℃進行記錄。使用MEA-2100-60-System（德國Multi Channel Systems 公司）記錄CA1 輻射層中的場興奮性突觸后電位（excitatory postsynaptic potentials，EPSP）。為了評估突觸的輸入輸出關系，研究測量了EPSP 的斜率。刺激強度是長時程增強（long-term potentiation，LTP）實驗中最大誘發反應的一半。LTP 由高頻刺激（HFS；100 Hz，三列，1 s持續時間，10 s 間隔時間）誘導。初始EPSP 斜率由控制期間的平均斜率值標準化。通過LTP-Director軟件獲取數據，并使用LTP-Analyzer 軟件進行數據分析。

1.5 高爾基染色根據快速高爾基染色試劑盒（美國FD Neurotechnologies 公司）進行高爾基染色。將小鼠的腦組織在室溫避光下在溶液A 和B的混合物中浸泡2 周，然后轉移到溶液C 中6 d。用低溫切片機（德國Leica 公司）將腦組織切成100 μm 切片，并使用X73 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）捕獲圖像。計算CA1 區每10 μm 突觸長度的二級突觸分支刺數和每10 μm 蘑菇刺的百分比。

1.6 蛋白質印跡分析將海馬組織（每組n= 6）置于玻璃勻漿器中在1∶107（w/v）冰冷的蛋白質提取緩沖液中勻漿。收集可溶性蛋白，4 ℃12 000g離心10 min，通過SDS-PAGE 分離蛋白質并轉移到PVDF 膜上。將膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，并在4 ℃下與以下一抗孵育過夜：抗AT8（1∶1 000；美國Chemicon 公司）和抗GAPDH（1∶5 000，美國Bioworld 公司）。用0.1% Tween 20/Tris 緩沖鹽水洗滌30 min 后，將膜與二抗在室溫下孵育2 h。使用ECL 試劑盒（美國Millipore 公司）可視化蛋白質信號，并使用Image J 軟件量化強度。

1.7 免疫熒光分析將腦組織（n= 6）固定72 h，然后由石蠟塊制成6 μm 厚的冠狀切片，或25 μm厚的冰凍切片（前囟后-1.46 ～-2.46 mm）。用0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）在90 ℃進行抗原修復15 min 后，用10%正常山羊血清阻斷非特異性結合。然后在4 ℃下應用特定的一抗孵育過夜：AT8、γH2AX（美國Chemicon 公司）。然后將切片與特異性Alexa Fluor 568 或488 二抗（美國Invitrogen 公司）在室溫下孵育2 h。用3 μmol/L 4'-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美國Sigma-Aldrich 公司）進行復染。在配備ZEN light 軟件的LSM 700激光掃描共聚焦熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss 公司）下觀察免疫標記的組織。所有定量分析均在至少四個圖像上進行，這些圖像是從至少三個獨立實驗中每只動物至少四個連續切片獲得。

1.8 統計學方法所有數據均使用SPSS 18.0 軟件進行分析。計量資料表示為均值±標準差，組間比較用t檢驗；多組比較用重復測量的單因素或雙向方差分析，后進行Bonferroni 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 APP/PS1 小鼠的海馬和血漿中miR-9-5p 降低與年齡匹配的野生型（WT）同窩小鼠相比，6 個月大的APP/PS1 小鼠海馬中有17 個miRNA 上調和47 個miRNA 下調（圖1A）。6月齡和9月齡APP/PS1 小鼠海馬中miR-9-5p 水平較WT 組顯著降低（圖1B）。此外，6 個月大的AD 小鼠血漿中miR-9-5p 水平降低（圖1C）。

圖1 APP/PS1 小鼠的大腦和血漿中的miR-9-5p 減少Fig.1 Decreased miR-9-5p in brain and plasma of APP/PS1 mice

2.2 外源性miR-9-5p 過表達可防止APP/PS1 小鼠的記憶和突觸損傷Lv-miR-9-5p 處理后，海馬和血漿中miR-9-5p的水平顯著升高（圖2）。為了研究miR-9-5p 過表達對APP/PS1 小鼠記憶功能的影響，在Lv 注射后30 d 進行了行為測試，包括新物體識別、恐懼條件和莫里斯水迷宮測試。與Lv-con組小鼠相比，Lv-miR-9-5p 組小鼠的辨別指數、關聯條件恐懼停止、暗示條件恐懼停止、跨平臺次數和目標象限時間均顯著增加（P＜0.05），和跨平臺時間顯著降低（P＜0.05），見表1。

圖2 在6 個月大的APP/PS1 小鼠的海馬中過表達外源性miR-9-5p 后海馬和血漿中miR-9-5p 水平Fig.2 Levels of miR-9-5p in hippocampus and plasma after overexpression of exogenous miR-9-5p in the hippocampus of 6-month-old APP/PS1 mice

表1 外源性miR-9-5p 過表達對APP/PS1 小鼠記憶損傷的影響Tab.1 Effect of exogenous miR-9-5p overexpression on memory impairment in APP/PS1 mice±s

表1 外源性miR-9-5p 過表達對APP/PS1 小鼠記憶損傷的影響Tab.1 Effect of exogenous miR-9-5p overexpression on memory impairment in APP/PS1 mice±s

注：與Lv-WT 組相比，**P ＜0.01，***P ＜0.001；與Lv-con 組相比，#P ＜0.05，###P ＜0.001

組別Lv-WT Lv-con Lv-miR-9-5p F 值P 值NOR 測試辨別指數0.73±0.08 0.58±0.06**0.75±0.05##4.216 0.038條件性恐懼測試關聯條件恐懼停止（%）78.26±4.21 54.32±3.77***75.49±3.58###5.136 0.015 MWM 測試跨平臺時間（s）6.74±0.45 15.26±1.83***10.44±0.79#8.564＜0.001暗示條件恐懼停止（%）74.82±4.06 49.13±3.41***75.63±3.85###5.287 0.013跨平臺次數3.88±0.48 1.63±0.24***2.84±0.28#7.842＜0.001目標象限時間（s）23.10±2.56 16.42±1.04***19.63±1.27#7.193＜0.001

2.3 外源性miR-9-5p 過表達可防止APP/PS1 小鼠的突觸損傷與Lv-con 組相比，Lv-miR-9-5p 組小鼠海馬中的突觸棘密度、蘑菇刺的百分比顯著增加（P＜0.05，圖3A-C），并且Lv-miR-9-5p 組小鼠表現出更高的長期增強幅度（圖3D）。

圖3 外源性miR-9-5p 過表達可防止APP/PS1 小鼠的突觸損傷Fig.3 Exogenous miR-9-5p overexpression prevents synaptic damage in APP/PS1 mice

2.4 外源性miR-9-5p 過表達可防止Tau 過度磷酸化免疫印跡和免疫熒光分析共同顯示，與Lv-WT組相比，Lv-con 組小鼠海馬中AT8（Ser202/Thr205）水平顯著升高（P＜0.05）。而Lv-miR-9-5p 組小鼠海馬中AT8（Ser202/Thr205）水平較Lv-con 組顯著降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 小鼠海馬中AT8 蛋白的免疫印跡和免疫熒光分析Fig.4 Immunoblot and immunofluorescence analysis of AT8 protein in mouse hippocampus

2.5 外源性miR-9-5p 過表達可防止Tau 過度磷酸化誘導的DNA 損傷海馬中Tau 過度磷酸化是疾病過程的標志，可能代表DNA 損傷。與Lv-WT組相比，Lv-con 組小鼠海馬中AT8 和γH2AX 共定位數量顯著升高（P＜0.05）。而Lv-miR-9-5p 組小鼠海馬中AT8 和γH2AX 共定位數量較Lv-con 組顯著降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 小鼠海馬中AT8 和γH2AX 的免疫熒光染色代表圖和定量分析Fig.5 Representative images and quantitative analysis of immunofluorescence staining for AT8 and γH2AX in the mouse hippocampus

3 討論

AD 的病因復雜，迄今為止，常規的藥物治療只能適當緩解AD 患者的某些癥狀，不可避免地會產生相應的副作用［2］。因此，揭示AD 發展的分子機制對于預防和治療具有重要意義。各種miRNA在中樞神經系統中異常表達，可能參與AD 的發生和進展［4-5］。本研究揭示了miR-9-5p 在AD 發病機制中的新作用。miR-9-5p 在6 個月大的APP/PS1小鼠的海馬和血漿中下調。Lv 介導的miR-9-5p 在海馬中的過表達改善了APP/PS1 小鼠的突觸可塑性并減輕了記憶缺陷。此外，miR-9-5p 過表達降低了Tau 過度磷酸化，并防止Tau 過度磷酸化誘導的DNA 損傷。因此，本研究結果表明miR-9-5p 在AD 發病機制中起重要作用，miR-9-5p 過表達可能是治療AD 的潛在療法。

miRNA 已被證明在突觸可塑性中發揮關鍵作用，突觸可塑性調節神經退行性疾病的發病機制，包括AD，如脆性X 智力遲鈍蛋白相關的miR-125b和miR-132 對突觸棘有抑制作用［12-13］。miR-181a在AD 小鼠中顯著上調，而抑制miR-181a 可減輕記憶缺陷并增加其靶標GluA2在AD小鼠中的表達［14］。miR-101b 已被證實在海馬神經元和AD 小鼠中調節APP，并且miR-101b 的過表達通過拯救組蛋白去乙酰化酶2來誘導Tau病理學和突觸、記憶障礙［15］。先前的研究表明，miR-9-5p 與神經發生和腦細胞活力有關［16］，在6 個月大的APP/PS1 小鼠的海馬中miR-9-5p 表達降低［8］；并且miR-9-5p 的表達在散發性AD 患者的額葉回和皮質中下調［17］。與這些研究一致，本研究證實APP/PS1 小鼠的海馬和血漿中miR-9-5p 降低，而miR-9-5p 過表達促進APP/PS1小鼠海馬突觸傳遞和增加突觸棘密度，這與改善記憶功能有關。

作為微管相關蛋白，Tau 蛋白在生理條件下穩定微管并參與其他細胞功能，如微管組裝、軸突運輸、信號轉導和細胞周期，這些功能受Tau 磷酸化的控制［18-19］。許多神經退行性疾病在中樞神經系統中存在顯著的Tau 病理學［20］。在Tau 病變中，細胞內可溶性Tau 形成聚集的、過度磷酸化的Tau 絲狀結構，這與突觸丟失和神經元死亡有關［21］。作為許多神經退行性疾病的標志性發現，在APP/PS1小鼠中觀察到異常Tau 磷酸化可能是認知障礙的主要原因［22］。此外，Tau 蛋白的異常過度磷酸化可能在麻醉或外周手術誘導的認知障礙和神經元凋亡的發病機制中發揮重要作用［23-25］。與先前研究報道的結果一致，本研究在6 個月大的APP/PS1 小鼠海馬中觀察到AT8 以及AT8 和γH2AX 共定位數量均顯著增加，證實了異常Tau 磷酸化的存在，并導致海馬DNA 損傷。值得注意的是，miR-9-5p 過表達逆轉了這些變化，表明miR-9-5p 在AD 發病機制中發揮重要作用。

總之，本研究數據證明了miR-9-5p 在AD 發病機制中的有益作用，其保護機制涉及減少異常Tau磷酸化和DNA 損傷。因此，miR-9-5p 過表達可能是AD 的潛在治療靶點。然而，miR-9-5p 過表達是否通過其他途徑參與保護AD 仍有待研究。