MiR-216a調節JAK2/STAT3通路抑制卵巢癌細胞的轉移和上皮-間質轉化

吳新華 顧曉荔 胡濱

鄭州大學第二附屬醫院婦產科（鄭州 450000）

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是致死率最高的婦科惡性腫瘤［1-2］。由于缺乏明顯臨床癥狀和診斷生物標志物，大多數卵巢癌患者在確診時就已處于疾病晚期，導致卵巢癌預后不佳［3-4］。因此，鑒定新的生物標志物并闡明卵巢癌發生發展的分子機制至關重要。微小RNA-216a（microRNA-216a，miR-216a）是一種與癌癥相關的miRNA，已被發現在乳腺癌［5］、胃癌［6］中下調，表明miR-216a具有腫瘤抑制作用。然而，有研究證實，miR-216a在卵巢癌組織和細胞中高表達，在卵巢癌中具有致癌作用［7］，與其他癌細胞中研究不同。因此，有必要對miR-216a 在卵巢癌中的具體生物學功能及其潛在的機制進行探究。據報道，Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在多種癌癥中發揮重要作用，該通路的激活可增加腫瘤的轉移能力和上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［8］。LIU 等［9］研究表明，抑制JAK2/STAT3 信號通路可抑制EMT 減弱卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲。EMT 作為腫瘤進展的關鍵調節劑，參與腫瘤侵襲、擴散等過程［10］。然而，在卵巢癌中miR-216a 是否可通過調節JAK2/STAT3 影響細胞的轉移和EMT 仍不明晰。本研究通過表達miR-216a，探索其對卵巢癌細胞的遷移和侵襲的影響以及潛在的作用機制，為卵巢癌的臨床治療提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人體組織樣本和細胞收集2019年1月至2021年1月期間來本院就診的20 例卵巢癌患者卵巢癌組織和癌旁正常組織（距離癌組織至少5 cm）樣本，術中采集組織后迅速于液氮中冷凍后于-80 ℃冰箱中保存備用。所有患者及其家屬均簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會批準。

人卵巢癌細胞系A2780（YS018C）、OVCAR3（YS3615C）、SKOV3（YS3110C）、3AO（YS908C）以及人卵巢上皮細胞HOSEpiC（YS1695C）均購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器DMEM 培養基、青/鏈霉素購自美國Gibco；TRIzol 試劑購自美國Invitrogen；TaqManTMmicroRNA 逆轉錄試劑盒、TaqManTMmicroRNA 檢測試劑盒購自美國Thermo；RIPA 裂解緩沖液、BCA 試劑盒購自江蘇Beyotime；一抗E-cadherin、N-cadherin、Vinmentin、JAK2、STAT3、Snalil、Twist、GAPDH 均購自英國Abcam；ECL 發光液購自北京BIOSIC；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海鈺博生物科技。

Varioskan LUX多功能酶標儀購自美國Thermo；LightCycler 480 熒光定量PCR 儀購自上海Roche；Gel Doc XR 凝膠成像系統購自美國Bio-Rad；EclipseTi-E 激光共聚焦熒光顯微鏡購自美國Nikon；CX43 顯微鏡購自美國OLYMPUS。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組卵巢癌細胞系（A2780、OVCAR3、SKOV3、3AO）以及人卵巢上皮細胞HOSEpiC 在補充有10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM 培養基中培養。將細胞維持在37 ℃、5%CO2的濕潤氣氛中，待細胞生長融合度至70%左右時進行傳代培養，取處于對數期且生長良好的第三代后的細胞進行后續研究。

取對數期生長的SKOV3 細胞，依次分為：正常對照（Control）組，miR-NC 對照（miR-NC）組、miR-216a 過表達（miR-216a）組、miR-216a 過表達和JAK2 過表達空載對照（miR-216a+EV）組、miR-216a 和JAK2 過表達（miR-216a+JAK2）組。轉染參照Lipofectamine 2000 轉染試劑盒方法轉染對應的質粒和寡核苷酸。miR-216a 模擬物（miR-216a）及其陰性對照miR-NC、JAK2 過表達（JAK2）及其空載對照（EV）均購自廣州Genecopoeia 設計合成。

1.2.2 QRT-PCR 檢測組織和細胞中miR-216a 表達水平根據TRIzol 試劑制造商說明書提取組織和細胞總RNA。遵循逆轉錄試劑盒說明書方法制備cDNA，使用microRNA檢測試劑盒對miR-216a進行PCR 擴增和定量。U6 作為內參基因，使用2-ΔΔct計算miR-216a 的相對表達水平。

miR-216a 引物序列：5'-ACACACUUACCCGUA-GAGAUUCUA-3'，反向引物使用試劑盒中通用的引物。U6 引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.3 Transwell 實驗檢測各組SKOV3 細胞的遷移和侵襲能力在實驗前，先使用Matrigel 包被Transwell 小室底部膜的上室面，干燥備用。將按照上述方法培養的各組SKOV3 細胞使用無血清的培養基重懸，形成5 × 105個/mL 的細胞懸浮液，吸取200 mL 懸浮液于含Matrigel 的Transwell 小室上室中，下室中添加600 mL 正常培養基。按常規方法培養48 h 后，使用甲醇固定30 min 后，添加0.1%結晶紫染色20 min，同時使用棉簽輕輕拭去上層未遷移細胞，使用PBS 輕洗3 遍后在倒置顯微鏡中拍照記錄，隨機選擇五個視野，計數。

細胞遷移實驗需使用無Matrigel 包被Transwell 小室，其余步驟同上。

1.2.4 免疫印跡（Western blot）檢測各組SKOV3細胞中EMT 和JAK2/STAT3 通路相關的蛋白水平變化使用RIPA 裂解緩沖液裂解按上述方法培養的各組SKOV3 細胞以獲得總蛋白提取物，并使用BCA 試劑盒測量蛋白質濃度。通過SDSPAGE 電泳分離總蛋白提取物（600 mg/泳道）后轉移到PVDF 膜上，添加5%牛血清白蛋白封閉2 h，將蛋白質與一抗（稀釋濃度1∶1 000）：E-cadherin、N-cadherin、Vinmentin、JAK2、STAT3、Slug、Twist 和GAPDH 在4 ℃下過夜孵育，隔天使用HRP 標記的二抗孵育2 h。使用增強型的ECL 發光液將蛋白可視化。并使用凝膠成像系統檢測信號并拍照記錄，通過Image J 軟件分析各組蛋白灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參灰度值。

1.2.5 免疫熒光檢測各組SKOV3 細胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vinmentin 表達水平將按照上述方法培養的各組SKOV3 細胞接種在細胞爬片上，待爬滿細胞后，使用PBS 浸洗3 次。在室溫下使用4%多聚甲醛固定后使用0.1% triton X-100 透化，添加山羊血清室溫封閉30 min，吸去封閉液后將細胞與一抗（稀釋比例1∶500）：E-cadherin、Ncadherin 和Vinmentin 在4 ℃下過夜孵育。后將爬片與FITC 熒光二抗在室溫下孵育1 h，細胞核在室溫下使用DAPI 染色10 min。使用激光掃描顯微鏡捕獲共聚焦熒光圖像。

1.2.6 雙熒光素酶檢測miR-216a 與JAK2 靶向關系經TargetScan 網站預測，miR-216a 與JAK2 3'-UTR 存在相互作用位點，將JAK2 3'-UTR 野生型（WT）或突變型（MUT）連接到螢火蟲熒光素酶報告載體上，構成JAK2 WT 或JAK2 MUT。將JAK2 WT 或JAK2 MUT 與miR-NC 或miR-216a 共同轉染至SKOV3 細胞，共同孵育48 h 后，經雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測相對熒光素酶活性。

1.3 統計學方法所有研究均進行3次獨立重復。使用SPSS 軟件分析實驗數據，用平均值±標準差的方式來表示，采用t檢驗分析兩組差異，使用單因素方差分析多組間差異。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-216a 在卵巢癌組織和SKOV3 細胞中的表達情況圖1A 結果顯示，與癌旁正常組織相比，miR-216a 表達水平在卵巢癌組織中的表達降低（t=80.63，P＜0.05）。圖1B 結果顯示，與HOSEpiC細胞相比，卵巢癌細胞系中miR-216a 表達均明顯降低（F= 142.089，P＜0.05）；且在SKOV3 細胞中表達最低，故后續選擇SKOV3 細胞作為研究對象。

圖1 qRT-PCR 檢測miR-216a 在卵巢癌組織和細胞中的表達情況Fig.1 qRT-PCR detection of miR-216a expression in OC tissues and cells

2.2 miR-216a 過表達促進SKOV3 細胞遷移和侵襲5 組SKOV3 細胞中miR-216a 表達、遷移和侵襲細胞數量差異均有統計學意義（F= 93.172、199.616、185.908，均P＜0.05）。與miR-NC 組相比，miR-216a 組SKOV3 細胞中miR-216a 表達升高，遷移和侵襲數量減少（P＜0.05）；與miR-216a+EV 組比，miR-216a+JAK2 組SKOV3 細胞中表達變化無統計學意義（P＞0.05），而遷移和侵襲數量增多（P＜0.05）。見圖2。

圖2 miR-216a 過表達對SKOV3 細胞遷移和侵襲的影響Fig.2 Effects of miR-216a overexpression on migration and invasion of SKOV3 cells

2.3 miR-216a 過表達抑制SKOV3 細胞的EMT5 組SKOV3 細胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白水平差異均有統計學意義（F=49.612、66.773、102.396，均P＜0.05）。與miR-NC 組相比，miR-216a 組SKOV3 細胞中E-cadherin 蛋白水平增高，N-cadherin 和Vinmentin 蛋白水平降低（P＜0.05）；與miR-216a+EV 組相比，miR-216a+JAK2 組SKOV3 細胞中E-cadherin 蛋白水平降低，N-cadherin 和Vinmentin 蛋白水平增高（P＜0.05）。免疫熒光進一步證實了以上各組SKOV3 細胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白水平變化結果（圖3）。

圖3 miR-216a 過表達對SKOV3 細胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 水平的影響Fig.3 Effects of miR-216a overexpression on the levels of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin in SKOV3 cells

2.4 miR-216a 過表達抑制SKOV3 細胞中JAK2/STAT3通路激活5組SKOV3細胞中JAK2、STAT3、Slug 和Twist 蛋白水平差異均有統計學意義（F=113.889、63.837、89.688、74.773，均P＜0.05）。與miR-NC 組相比，miR-216a 組SKOV3 細胞中JAK2、STAT3、Slug 和Twist 蛋白水平均降低（P＜0.05）；與miR-216a+EV 組比，miR-216a+JAK2 組SKOV3 細胞中JAK2、STAT3、Slug 和Twist 蛋白水平均增高（P＜0.05，圖4）。

圖4 miR-216a 過表達對JAK2、STAT3、Slug 和Twist 蛋白水平的影響Fig.4 Effects of miR-216a overexpression on the protein levels of JAK2，STAT3，Slug and Twist

2.5 雙熒光素酶實驗檢測SKOV3 細胞中miR-216a 與JAK2 靶向關系生物學預測，JAK2 3'-UTR 存在與miR-216a 相互作用的靶向結合位點（圖5A），經雙熒光素酶實驗證實，與miR-NC 組相比，miR-216a 組SKOV3 細胞中轉染JAK2 WT 可顯著降低熒光素酶活性（t= 16.333，P＜0.05），而轉染JAK2 MUT 則對熒光素酶活性的影響差異無統計學意義（t=16.333，P=0.332，圖5B）。

圖5 miR-216a 與JAK2 靶向關系驗證Fig.5 Validation of the targeting relationship between miR-216a and JAK2

3 討論

miRNAs 是一組長度為20-22 個核苷酸的非編碼小RNA，可在轉錄后調控靶基因的表達，并在調節組織特異性蛋白表達方面發揮著重要作用［11］。越來越多的研究證實，異常miRNA 表達通過充當致癌基因或腫瘤抑制因子而與人類癌癥的發展和進展直接相關。此外，miRNAs 已被公認為是最有潛力的生物標志物和包括卵巢癌在內的人類癌癥的治療靶點［12-13］。miR-216a 已被發現是人類惡性腫瘤的積極參與者［14-15］。本研究結果顯示，miR-216a 在卵巢癌組織和細胞中顯著低表達，且在SKOV3 細胞中表達最低，表明miR-216a 在卵巢癌中具有抑癌作用。有研究發現，miR-216a 的表達在胃癌組織和細胞系中受到抑制，低表達的miR-216a 與胃癌患者的惡性臨床特征和不良預后相關，且miR-216a 可能通過抑制JAK2/STAT3 通路的激活來抑制胃癌細胞的遷移、侵襲和EMT 過程［16］。然而，在肝細胞癌中，A1BG-AS1 通過直接吸附競爭性內源性miR-216a 表達抑制腫瘤細胞遷移和侵襲，而過表達miR-216a 可逆轉A1BG-AS1 對癌細胞的影響，說明miR-216a 在肝細胞癌中具有致癌作用［17］。本結果與之相一致。為了進一步明確miR-216a在卵巢癌細胞中的具體生物學功能，進一步實驗證實過表達miR-216a 抑制遷移、侵襲，且表現出高E-cadherin 蛋白水平，低N-cadherin 和Vinmentin蛋白水平。有研究表明，EMT 是上皮細胞獲得間充質特征從而獲得轉移能力的過程，與腫瘤的發生、轉移及治療抵抗有關［18］。以往研究發現，EMT過程發生的標志是高N-cadherin 和Vinmentin 水平，低E-cadherin 水平［19-20］。結合本研究結果表明miR-216a 過表達抑制卵巢癌細胞的遷移、侵襲和EMT 過程，暗示miR-216a 很有可能作為治療卵巢癌的潛在生物標志物。然而，本研究中發現的miR-216a 在卵巢癌中的功能與現有研究結果并不相同［7］，推測其可能有多方面原因，其一：選用的卵巢癌患者組織具有差異，循環中的miRNA 水平不僅與腫瘤類型有關，還可能受到慢性疾病、炎癥等的影響；其二，單個miRNA 可以靶向調控上百個mRNA，根據不同靶基因的能力其表達趨勢可能不同；其三，miRNA 即使靶向相同的基因，在不同的轉移階段也會具有不同的結果。綜上，有必要對miR-216a 在卵巢癌中的作用機制進行深入探究。

本研究經生物信息學預測發現，JAK2 可能是miR-216a 的靶標基因。經雙熒光素酶結果證實，miR-216a 與JAK2 存在相互作用。另外，上調miR-216a 可顯著降低JAK2 蛋白水平，表明miR-216a 對JAK2 具有負向調控作用。據報道，JAK2 是蛋白酪氨酸激酶JAK 家族的成員之一，在腫瘤細胞中發揮著多種功能［21］。先前的研究表明，JAK2 在各種類型的癌癥中通過調節STAT3 發揮致癌基因的作用［22］。有研究表明，在結直腸癌細胞中，JAK2/STAT3 信號被激活后，癌細胞的增殖能力提高［23］；在食管鱗狀癌細胞中阻斷JAK2/STAT3 信號，可明顯抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲［24］。此外，已有研究證實，JAK2/STAT3 通路在卵巢癌細胞的轉移和EMT中起著關鍵作用［25］。結果顯示，上調miR-216a表達可抑制JAK2、STAT3 蛋白水平及其下游靶標Slug 和Twist 蛋白表達。研究顯示，轉錄因子Slug和Twist 是人類卵巢癌中EMT 過程的關鍵調節因子［26］。因此，筆者假設miR-216a 通過抑制JAK2 表達抑制JAK2/STAT3 通路激活進而抑制卵巢癌細胞的EMT 過程和轉移。進一步研究表明，JAK2 過表達部分逆轉上調miR-216a 對卵巢癌細胞的抗轉移作用，具有增強遷移、侵襲和EMT 進展的作用，這些數據有利地支持了上述假設。

綜上，本研究證明了miR-216a 的表達在卵巢癌組織中下調，miR-216a 可能通過抑制JAK2/STAT3 通路抑制卵巢癌細胞的遷移、侵襲和EMT。這些發現為卵巢癌的靶向治療提供了新的觀點。但本研究未在其他卵巢癌細胞系和動物模型中進行同步驗證，后續仍需更全面的探究以完善miR-216a 在卵巢癌中的作用機制，以期為卵巢癌的治療提供新的思路。