橫向定量牽拉損傷對大鼠視網膜神經節細胞自噬水平的影響

尚孟秋，廖 良，吳 瓊，孫 武，夏燕婷，王露露，王 妍，曹琳琳

0 引言

外傷性視神經病變(traumatic optic neuropathy，TON)在閉合性頭顱外傷中約占2%～5%[1]，是眼外傷的重要急癥之一，也是頭部損傷中的嚴重并發癥之一。該病預后不佳，患者常出現急性視功能下降，超過60%的患者視力僅為光感甚至無光感[2]。目前治療視神經損傷的方法主要有視神經管減壓術和激素沖擊治療等。然而，目前還沒有一種藥物或手術方法對受損視神經的保護有明確的療效。探究視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)的損傷機制、尋求更有效的保護RGCs的措施是研究TON的熱點。實驗動物模型是研究TON損傷保護的關鍵技術之一，本課題組前期實驗證實橫向定量牽拉法可導致大鼠RGCs損傷[3]，但損傷的具體機制尚待進一步研究。大量研究發現，自噬(autophagy)的發生與細胞凋亡、壞死密切相關。自噬是細胞在應激條件下的一種自我保護過程，細胞在外界環境因素的影響下，對其內部受損的細胞器、錯誤折疊蛋白質和侵入其內的病原體進行降解；病理條件下，自噬作為適應性應激反應能夠有效促進細胞存活[4]，這對外傷后RGCs的保護非常重要。為進一步研究自噬對TON后RGCs的影響，本研究運用閃光視覺誘發電位(flash visual evoked potential，f-VEP)技術與分子生物學技術探索牽拉傷對大鼠RGCs自噬水平的影響。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組選擇SPF級健康雄性SD大鼠30只(購自北京維通利華實驗動物有限公司)，體質量220±20g，雙眼外觀正常，檢查雙眼屈光間質清，瞳孔等大等圓，對光反射靈敏，眼底無異常。飼養于北京中醫藥大學東方醫院實驗中心，自由攝食、飲水，室內通風干燥。按照隨機數字表分為空白組、假手術組、0.15N(牛頓)組、0.3N組、0.6N組，每組各6只。本研究通過北京中醫藥大學動物實驗倫理審查(No.202007)。

1.1.2主要試劑和儀器設備主要試劑：蘇木素染液(MDL，貨號MD911477)；DAB kit(中杉金橋，貨號ZLI-9017)；LC3B抗體(Cell signaling，貨號83506s)；Brn-3a抗體(Abcam，貨號ab245230)；二抗(MDL，貨號MD912566)。主要儀器設備：石蠟切片機(Leica，RM2235)；顯微鏡(Leica，DM3000)；電泳儀(北京百晶生物技術有限公司，BG-subMIDI)；ChemiDoc MP化學發光成像系統(Bio-rad，170-8280)。

1.2方法

1.2.1視神經牽拉傷模型構建采用橫向定量牽拉法制作視神經損傷大鼠模型[5]，具體方法如下：2%戊巴比妥鈉腹腔注射全身麻醉大鼠，待角膜反射消失，用鑷子輕夾下肢腳趾無反應時即為麻醉成功；麻醉成功后取俯臥位，在體式顯微鏡下操作，剪開大鼠右眼顳側眶緣皮膚約1cm，摘除部分眶脂肪，剪斷(亦可保留)上直肌和外直肌，向眶尖部鈍性分離直至暴露視神經，采用6-0聚酯縫合線在球后1～2mm處圈住視神經并打結(圈長等于視神經橫截面周長，注意不能拉緊)，縫線另一頭連接橫向拉力計(最小刻度0.01N)，根據分組不同，以0.15、0.3、0.6N拉力垂直于視神經水平牽拉并持續20s。牽拉完成后立即觀察，如術眼瞳孔散大、直接對光反射消失、間接對光反射存在、眼底視網膜無血管閉塞，則為造模成功。空白組大鼠不予處理。假手術組僅暴露視神經，不予牽拉。造模成功后，將眼球恢復原位，縫合傷口，在眼瞼上涂用紅霉素眼膏敷眼以抗炎，后將大鼠放回籠中，觀察呼吸有無異常。

1.2.2f-VEP測量各組隨機選擇大鼠1只，于造模后第1、3d將大鼠暗適應2h；麻醉方法同前；麻醉成功后將大鼠固定于視覺電生理儀托盤上，雙眼各點1滴復方托吡卡胺充分散瞳；對側眼使用不透光眼罩遮蓋；連接電極，記錄電極從雙耳連線中點皮下向頭側進針約1cm，參考電極置于待查眼的同側頰部，地電極置于尾部皮下；使用眼科羅蘭電生理儀進行測量，每只眼球重復測量3次，使用儀器自動峰型識別確定實驗大鼠f-VEP P2潛伏期和振幅(其中P2振幅為P2-N2數值)。

1.2.3取材各組均于造模后第3d取材。10%水合氯醛過量麻醉處死大鼠，完整摘取眼球，每組隨機選取2只眼球投入多聚甲醛固定液中進行免疫組織化學和透射電子顯微鏡觀察，其余4只眼球置于冰上分離視網膜，沿冠狀面剪去角膜、虹膜及晶狀體，用鑷子緩慢鈍性分離視網膜，小心剝離視網膜置于凍存管中，立即投入液氮保存。

1.2.3.1免疫組織化學染色觀察RGCs存活情況視網膜組織切片脫脂，逐次水化，去除過氧化物酶，抗原修復，羊血清封閉后，加入一抗Brn-3a抗體(1∶200)，4℃搖床孵育過夜，加入相應的二抗，于37℃恒溫箱中孵育，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，梯度脫水，烤干封片。每張切片隨機選取10個高倍視野，采用定量軟件Image J分析結果，藍色有核細胞數量為視網膜神經節細胞層(GCL)細胞總數，棕色細胞數量為含Brn-3a蛋白的細胞(陽性細胞)數，即RGCs存活細胞數，記錄各組GCL層的細胞總數和陽性細胞數，計算陽性細胞百分比。

1.2.3.2透射電子顯微鏡觀察自噬小體變化視網膜組織經1%鋨酸固定、2%醋酸水溶液快速染色、乙醇脫水、浸透、包埋、切片后，采用醋酸鈾和枸櫞酸鉛進行雙重染色后用清水洗凈，置于透射電子顯微鏡下觀察視網膜組織中自噬小體并拍照記錄。

1.2.3.3Westernblotting檢測視網膜組織中自噬相關蛋白表達水平取視網膜組織，每組4個視網膜混合為1個樣本，冰浴超聲裂解組織后，用BCA法測定蛋白濃度，取60μg樣品，加入Buffer緩沖液，混勻。100℃沸水處理10min，蛋白變性。采用蛋白質印跡Western blotting法檢測視網膜組織自噬相關蛋白LC3BⅡ/Ⅰ表達水平。β-actin作為內參。UVP軟件采集圖片結果，Image J軟件計算各組灰度值。

2 結果

2.1各組大鼠f-VEPP2潛伏期和振幅比較造模后第1、3d，各組大鼠f-VEP檢查均可引出正常N-P-N波形。與假手術組相比，造模后第1d，各模型組手術眼振幅及潛伏期差異均無統計學意義(P>0.05)，但造模后第3d各模型組手術眼振幅均降低，潛伏期延長，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明造模后大鼠視神經傳導功能下降。此外，造模后第3d，各模型組手術眼潛伏期較造模后第1d延長，但差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖1，表1。

表1 各組大鼠手術眼f-VEP P2潛伏期和振幅比較

圖1 各組大鼠f-VEP P2潛伏期和振幅比較 A：造模后第1d；B：造模后第3d。

2.2各組大鼠RGCs存活情況各組大鼠視網膜GCL層均可見Brn-3a表達，陽性細胞百分比差異有統計學意義(F=11.05，P=0.001)，0.15N組、0.3N組、0.6N組陽性細胞百分比低于假手術組，0.6N組陽性細胞百分比低于0.15N組和0.3N組，差異均有統計學意義(P<0.05)。表明模型組RGCs存活率低于假手術組，且0.6N組較0.15N組和0.3N組低，見圖2，表2。

表2 各組大鼠視網膜GCL層陽性細胞百分比

圖2 免疫組織化學染色觀察各組大鼠RGCs存活情況 A：空白組；B：假手術組；C：0.15N組；D：0.3N組；E：0.6N組。RNFL：神經纖維層；GCL：神經節細胞層；IPL：內叢狀層；INL：內核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層。紅色箭頭：Brn-3a表達陽性細胞；黑色箭頭：其他細胞。

2.3各組大鼠視網膜組織中自噬小體情況空白組和假手術組大鼠RGCs形態較正常，有較完整的細胞核、線粒體、溶酶體，而0.15N組、0.3N組、0.6N組大鼠RGCs形態破壞，出現較多空泡結構，并可見大量增加的溶酶體。各組均可見由膜包裹部分細胞質和細胞內需要降解的細胞器、蛋白質等形成封閉的、圓球形的結構，即自噬小體，見圖3。

圖3 透射電子顯微鏡觀察各組大鼠視網膜組織中自噬小體 A：空白組；B：假手術組；C：0.15N組；D：0.3N組；E：0.6N組。每組右圖為左圖黑色框放大3倍，黑色箭頭示自噬小體。

2.4各組大鼠視網膜組織中LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達水平各組大鼠視網膜組織中LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達水平比較，差異有統計學意義(F=11.81，P=0.001)。與假手術組相比，模型組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達水平均降低，其中0.3N組和0.6N組與假手術組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，LC3BⅡ/Ⅰ表達水平隨牽拉力度增加依次遞減，但各模型組間差異均無統計學意義(P>0.05)。表明0.3N組和0.6N組大鼠視網膜組織中自噬蛋白表達水平較假手術組降低，見圖4，表3。

表3 各組大鼠視網膜組織中LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達水平比較

圖4 Western bloting檢測各組大鼠視網膜組織中LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達水平 A：Western bloting檢測結果；B：Western bloting量化分析結果。

3 討論

TON是指由于外力沖擊造成的急性視神經損傷，其病理機制多為直接或間接性損傷造成的視神經撕斷[6]、視神經軸漿流阻斷及視神經缺血性梗死，導致RGCs變性壞死，引起RGCs凋亡，最終引起嚴重的視功能障礙。RGCs的不可逆損傷和選擇性丟失是TON發生發展的病理基礎[7]。Brn-3a在鼠RGCs的分化、存活及軸突發育過程中具有重要作用，可作為存活的RGCs的標記物，用于體外識別大鼠視網膜RGCs，且其在視網膜損傷后表達模式沒有改變，因此，Brn-3a可以作為一種可靠的標記物用于定量評估RGCs的數目[8]。在動物模型中，大鼠f-VEP較易記錄，波形易辨認，能反映大鼠視網膜和視覺傳導通路基本功能狀態的改變，可作為實驗中的常規指標使用[9]。f-VEP中P2較為穩健，因此P2潛伏期及P2振幅變化在臨床上最為常用[10-11]。P2波峰延遲常見于脫髓鞘疾病，P2振幅降低常見于以視神經軸索變性壞死為主要病理改變的疾病。研究表明，在大鼠缺血性視神經病變模型中，P2振幅可用于評估RGCs的結構和功能，RGCs損失可導致P2振幅衰減[12-13]。本研究結果表明，模型組大鼠f-VEP振幅及RGCs存活率均較假手術組降低，表明成功造成大鼠手術眼出現視神經損傷并引起RGCs改變。

自噬是一種溶酶體依賴性的自我降解途徑，其發生的關鍵是自噬小體的形成，在透射電子顯微鏡下觀察到自噬小體結構是檢測自噬發生的金標準。自噬相關蛋白LC3是哺乳動物細胞中酵母自噬相關基因8的同源物，靶向定位于自噬體膜分為Ⅰ型和Ⅱ型[14]。自噬發生時，Ⅰ型與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺結合，形成Ⅱ型LC3，LC3 Ⅱ蛋白結合并始終位于細胞內自噬體膜上，其含量與自噬泡數量呈正比，被認為是自噬體的標志分子[15]。

本研究發現，視神經牽拉傷3d后大鼠視網膜組織中自噬水平出現下降，且牽拉的力度與自噬水平呈負相關。視神經損傷后自噬產生的時間仍存在爭議，Lee等[16]研究發現青光眼模型大鼠在眼壓升高7d后自噬蛋白的表達增加具有統計學意義，且第1、3d自噬蛋白表達水平出現下降；Russo等[17]通過前房加壓制備大鼠視網膜缺血、RGCs凋亡模型，造模后第6h自噬蛋白表達增加，第24h自噬蛋白水平下降至與第0h差異無統計學意義。以上研究表明大鼠視神經損傷后的自噬水平可能于第6h, 7d出現兩次明顯增加，但在6h與7d間自噬水平與損傷前無明顯增加甚至下降。本研究結果表明，視神經牽拉傷3d后自噬水平出現下降，且自噬水平與牽拉力度呈負相關，可能與自噬水平高峰未到，同時RGCs的死亡有關。Lee等研究證明自噬激活劑雷帕霉素及饑餓均可提高自噬水平保護高眼壓模型大鼠RGCs的存活，自噬可降低RGCs對氧化損傷的反應，抑制細胞凋亡以促進細胞存活[18]，此外神經元自噬可以阻止受損細胞器聚集和神經元中蛋白質的積累，并通過清除軸突碎片或重塑細胞骨架以保護細胞功能[19]。本研究中大鼠視網膜自噬水平與RGCs存活數量呈正相關，證明自噬可能對RGCs具有保護作用。

然而，本研究尚存在不足之處：(1)因f-VEP檢查具有個體間差異及重復測量差異大的特點，本研究中各組大鼠P2潛伏期及振幅對比對其視功能的改變的可信度有限，但由于動物實驗的局限性，尚無更有效證明大鼠視功能變化的檢查；(2)由于經費限制，本研究每組僅有6只大鼠，樣本量較小。基于上述問題，本課題組將開展大樣本研究，并進一步探索橫向牽拉法影響視網膜組織自噬的分子生物學信號調控機制。

綜上所述，橫向牽拉法可制作精確定量的視神經損傷模型，并造成手術眼視網膜自噬水平下降、RGCs死亡和相應的神經傳導功能障礙，且不同牽拉力造成的損傷程度不同，該模型建立方法難度適中，具有較高可重復性，且可模擬輕、中、重不同程度的TON病變，是開展TON基礎研究的良好模型。此外，本研究表明RGCs存活情況可能與其自噬水平有關，這也為通過調節自噬促進TON患者RGCs存活、保護視功能的研究提供了方向。