MWCNT-PEI對細菌菌膜生長和結構的影響

余益成，王珊珊，殷 敏，呂 敏

（上海師范大學化學與材料科學學院，上海 200234）

0 引言

細菌菌膜是細菌附著在生物或非生物表面，生長為由自身產生的胞外聚合物基質（EPS）包裹的多細菌群落［1］.其中，由多糖、蛋白質和胞外DNA等生物大分子交聯形成的黏性EPS對細菌起著重要的保護作用.因此，菌膜被認為是細菌抵御環境風險和壓力的重要生存模式.這種生長方式極大地影響著人類的生活環境和健康安全，備受生物醫學、工業和地理環境等領域關注［2-3］.菌膜對環境和健康的影響有利有弊：一方面，致病細菌菌膜誘發的急慢性感染疾病，嚴重威脅著人類的健康和安全［4-6］；另一方面，有益的細菌菌膜在處理地球物質循環、工廠廢水和降解有毒化合物生物等方面發揮著積極作用.細菌菌膜的生長與周圍環境條件密切相關，環境條件的改變會導致菌膜結構和組成的改變［7-8］.因此，維持環境穩態對于細菌菌膜實現環境物質分解和循環起著至關重要的作用.

納米科技的興起和發展，涌現出大量具有優異抗菌性和抗菌膜特性的納米材料，比如金屬納米顆粒、金屬氧化物納米顆粒以及碳族納米材料［9-12］.特別是多壁碳納米管（MWCNT）作為一種優異的納米抗菌材料受到了廣泛關注.CHEN等［13］發現單壁碳納米管和MWCNT可以通過膜去極化抑制細菌生長.近年來，研究發現碳納米管對菌膜的生長也有顯著的影響.在菌膜形成的初始階段，單壁碳納米管與細菌相互作用并抑制其生長；但是，成熟菌膜對碳納米管具有高度抗性.這是因為在成熟的菌膜中，細菌分泌大量的胞外多聚物減輕了碳納米管的毒性［14-15］.由于碳納米管具有大的比表面積和豐富的官能團，研究人員構建了豐富多彩的功能化碳納米管［16］.其中，多聚物修飾碳納米管不僅改善了碳納米管在生理介質中的分散性，而且因其兼具碳納米管和多聚物材料的特殊理化性質，被廣泛用于涂料包裝、橡皮筋、垃圾袋等原材料［17-18］.這些塑料產品最終將隨著消費使用結束釋放到環境中，會與微生物群落發生強烈的相互作用，這種作用是否會導致細菌個體及群體生長的改變，成為納米毒理學和環境科學領域關注的焦點.

本文作者利用共價接枝的方法合成了MWCNT接枝聚乙烯亞胺（MWCNT-PEI）；選擇誘發呼吸道囊性纖維化疾病的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）為模式菌株，系統研究了MWCNT-PEI與浮游細菌和菌膜的相互作用.結果顯示：MWCNT-PEI可以有效抑制銅綠假單胞菌生長，而且抗菌作用還呈現濃度依賴性.此外，MWCNT-PEI會影響菌膜的生長周期，導致菌膜成熟期提前；高濃度MWCNT-PEI促使菌膜分散期提前.另外，MWCNT-PEI會改變成熟菌膜的結構組成，刺激細菌分泌大量的EPS.這些結果為深入理解納米材料與菌膜相互作用提供了新理論，也為評估碳納米材料對環境微生物的影響提供了科學指導.

1 材料與方法

1.1 材 料

肉湯培養基（LB）和瓊脂粉（Agar），均采購于生工生物工程（上海）股份有限公司；濃硫酸、濃硝酸、MWCNT和支化聚乙烯亞胺（PEI），均采購于西格瑪奧德里奇貿易有限公司（Sigma-Aldrich）；SYTO9綠色熒光核酸染料購自英濰捷基貿易有限公司（Invitrogen）；Alexa Fluor?594與刀豆蛋白A的偶聯物和結晶紫（CV）均采購于賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）.

1.2 實驗儀器

紫外分光光度儀（Shimadzu UV-18000）；超聲速離心機（Beckman Coulter DU 730）；透射電子顯微鏡（TEM，JEOL 2100）；動態光散射分析儀（DLS，Malvern Nano-ZS90）；酶標儀（Thermo Multiskan MK3）；離心機（Eppendorf Centrifuge 5424R）；超聲機（XM300UHP）；激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8）；恒溫培養箱（LRH-70F）；恒溫震蕩培養箱（THZ-C-L）；垂直層流凈化工作臺（CA-920-2）.

1.3 實驗方法

1.3.1 MWCNT-COOH的制備

0.75 g MWCNT分散于60 mL濃硫酸和20 mL濃硝酸中，在60℃，460 r·min-1條件下反應6 h.待反應完，反應體系靜置、冷卻至室溫.然后，真空抽濾，洗滌至中性pH=7，得到羧基化酸化的多壁碳納米管（MWCNT-COOH）.在冰面上超聲30 min，超聲探針尖端6 mm，振幅10%.測得500 nm處吸光度（按吸光系數39.92 mg·mL-1計算），計算MWCNT-COOH質量濃度［19-20］.

1.3.2 MWCNT-PEI的制備

將MWCNT-COOH與PEI按質量比為1∶10的比例在水溶液中混合，超聲10 min；在84℃，460 r·min-1條件下反應16 h.待反應停止，冷卻至室溫，用孔徑為0.45 μm的濾膜進行真空抽濾，洗去未反應的PEI，反復洗10次.將MWCNT-PEI冷卻至室溫，真空烘干.

1.3.3 銅綠假單胞菌的培養

取3 μL凍于-80℃的銅綠假單胞菌液接種于3 mL LB肉湯培養基，搖床（37℃，220 r·min-1）過夜培養，取對數期生長的菌液在瓊脂平板上劃線培養，長出單菌落，保存4℃冰箱中備用.

1.3.4 MWCNT-PEI對浮游銅綠假單胞菌生長的影響

挑取備用瓊脂平板的單菌落于3 mL的LB中，搖床（37℃，220 r·min-1）培養過夜.取1 mL對數期菌液離心（10 000 r·min-1，30 s），磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2次，去掉死細菌.稀釋后，用分光光度計測600 nm處的吸光度數值（OD600），確定細菌濃度（即每毫升的菌落數）.分散于PBS的細菌（終濃度約為107CFU·mL-1）與不同質量濃度的MWCNT-PEI（5，10，20 μg·mL-1）作用60 min，用平板計數法數細菌數目，計算細菌存活率：

1.3.5 MWCNT-PEI對細菌菌膜生長動力學的影響

細菌濃度為105CFU·mL-1的50 μL菌懸浮液加入96孔板，然后加入50 μL MWCNT-PEI，使其最終質量濃度為0，5，10，20 μg·mL-1，放置培養箱進行培養.選取細菌菌膜生長過程中不同時間點（2，6，20，24，28，36和48 h）測定的細菌菌膜的生物量.

CV染色法可用于細菌菌膜生物量的測定.生長到一定時間點的菌膜，用PBS輕輕地洗3次，去除懸浮細菌，自然風干3 min.然后，用質量分數為0.1%的CV染液染色15 min，吸去CV染液后，用PBS洗3次，再加入體積分數為95%乙醇脫色15 min，酶標儀測試595 nm處的吸光值.

1.3.6 MWCNT-PEI對細菌菌膜結構的影響

使用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）研究菌膜的結構，終濃度為107CFU·mL-1的菌液加入24孔板，然后分別加入質量濃度為0，5，10，20 μg·mL-1的MWCNT-PEI，進行培養.培養24 h后，PBS洗1次，熒光染料SYTO9（激發光/發射光為488/500 nm）染色15 min，洗去多余染料；再用Alexa Fluor?594（激發光/發射光為561/590 nm）與刀豆蛋白A的偶聯物染色20 min；最后，用CLSM進行觀察，以z軸步長為1 μm掃描菌膜獲取3D菌膜圖，所得3D圖像通過LAS AF軟件進行分析，確定MWCNT-PEI對細菌菌膜的結構的影響.

2 結果與討論

2.1 MWCNT-PEI的合成與表征

MWCNT羧基化后，通過共價接枝的方法制備MWCNT-PEI，如圖1（a）所示［21］.使用TEM觀察碳納米管的形貌，如圖1（a）和1（c）所示，結果顯示：混酸處理的MWCNT-COOH和MWCNT-PEI結構完整，呈管狀結構；MWCNT和MWCNT-PEI的直徑分別約為11 nm和13 nm，說明MWCNT-COOH表面接枝了PEI.Zeta電位測試佐證了MWCNT-PEI的成功合成.如圖1（d）所示，MWCNT-COOH帶負電，電位為-55.4 mV；當接枝帶正電的PEI后，MWCNT-PEI的Zeta電位上升到47.7 mV.碳納米材料的分散性與生物效應密切相關［22］.因此，評估了MWCNT在不同介質中的穩定性.如圖1（e）所示，MWCNT-PEI在多種介質中都能保持良好的穩定性和分散性.

圖1 MWCNT-PEI的合成及表征.（a）MWCNT的TEM圖；（b）MWCNT的粒徑分析圖；（c）MWCNT-PEI的TEM圖；（d）MWCNT-PEI的粒徑分析圖；（e）Zeta電位圖；（f）不同介質中的穩定性

2.2 MWCNT-PEI抑制浮游細菌生長

碳家族納米材料包括零維富勒烯、一維碳納米管、二維石墨烯等碳納米材料及其衍生物，它們作為一類新型納米抗菌材料在納米生物學領域備受關注［23-25］.大量報道證實，MWCNT有優良的抗菌性能［13］，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭氏陽性菌和陰性菌都有很好的抑制和殺滅效果.采用平板計數法評估了MWCNT接枝多聚物后對銅綠假單胞菌活力的影響.結果如圖2所示，與對照組相比，銅綠假單胞菌在不同濃度MWCNT-PEI（5，10，20 μg·mL-1）暴露60 min后，細菌數量隨MWCNT-PEI質量濃度的增加而減少.MWCNT-PEI為5 μg·mL-1時，超過50%的細菌失活；MWCNT-PEI的質量濃度增加到20 μg·mL-1時，幾乎沒有細菌存活，殺菌率高達96%.以上結果表明：MWCNT-PEI具有優異的抗菌性能，可以有效抑制銅綠假單胞菌生長，而且這種抗菌能力還呈現濃度依賴性.

圖2 MWCNT-PEI的抗菌性.

2.3 MWCNT-PEI對菌膜形成的影響

菌膜是細菌在自然界的主要生存方式.研究發現：菌膜形成是一個動態過程，主要包括4個階段：1）細菌不可逆地附著在生長基底表面上；2）黏附的細菌細胞進行分裂增殖，形成細菌團，同時產生大量的胞外多聚物基質（EPS）；3）形成成熟細菌菌膜；4）菌膜分散，即菌膜內的細菌分散逃逸，形成新的聚集體，開始新一輪菌膜形成［6］.環境因素（例如抗菌劑［26］、機械壓力［27］或滲透壓［28］等）顯著影響菌膜的形成和結構.多聚物修飾MWCNT的廣泛研究和應用使其在環境中的釋放量不斷增加［18］.在浮游細菌中加入MWCNT-PEI，模擬碳納米管釋放到環境中與細菌相互作用，觀察其對菌膜形成的影響.

CV染色觀察和分析（圖3）顯示，正常菌膜和不同質量濃度MWCNT-PEI處理的菌膜都經歷了相似的生長階段和生長趨勢.它們都是從最初的黏附到逐漸成熟的生物膜，生物量不斷增大，最終達到峰值；成熟菌膜因為營養匱乏和氧氣壓力等原因［6］，開始彌散形成新的細胞團，生物量開始顯著減少.但是，MWCNT-PEI促使菌膜提前到達成熟期，正常菌膜在20 h后到達成熟期，MWCNT-PEI處理后的菌膜12 h后已趨于成熟.這種現象可能是因為低濃度的碳納米管不足以殺死所有的細菌，而且碳納米管大的比表面積使其能夠吸附生物大分子，為細菌生長提供支點［29］.高濃度MWCNT-PEI（20 μg·mL-1）還會導致菌膜的分散時間提前到36 h.這可能是在菌膜的形成過程中，由于氧氣和營養物的減少，導致菌膜提前進入分散期.然而，MWCNT-PEI對成熟菌膜的最大生物量幾乎沒有影響.

圖3 MWCNT-PEI對銅綠假單胞菌菌膜生長的影響.（a）菌膜的CV染色圖；（b）將細菌分別與不同質量濃度的MWCNT-PEI（0，5，10和20 μg·mL-1）作用48 h的菌膜生長曲線

2.4 MWCNT-PEI對成熟菌膜結構的影響

為了深入分析成熟菌膜的結構，用SYTO9和Alexa Fluor?594與刀豆蛋白A的偶聯物分別標記菌膜中的細菌和EPS，使用CLSM進行熒光成像和定量分析.如圖4（a）所示，與對照組相比，MWCNT-PEI的加入導致成熟菌膜中綠色熒光的強度減弱，紅色熒光增強，這說明MWCNT-PEI會導致成熟菌膜中的細菌數目減少，EPS分泌量提高.細菌抵御抗菌劑時，會啟動應激保護機制，即分泌大量EPS包裹自身，阻擋或隔絕抗菌劑的直接作用.圖4（b）為熒光圖量化數據，與對照組相比，MWCNT-PEI顯著降低了菌膜厚度，這與材料具有抗菌性相關.而質量濃度為10 μg·mL-1的MWCNT-PEI刺激細菌分泌大量EPS，這說明亞致死量的抗菌劑誘發細菌啟動了應激機制.盡管MWCNT-PEI對成熟菌膜的總生物量幾乎沒有影響，但是會影響菌膜的結構組成（細菌數目降低，EPS分泌增加），這對于菌膜處理工廠的污水有著非常重要的應用價值.

圖4 菌膜熒光染色圖像.（a）銅綠假單胞菌菌膜的3D-CLSM圖；（b）不同質量濃度下（0，5，10和20 μg·mL-1）菌膜中的細菌、EPS生物量的高度分布圖

3 結論

綜上所述，本工作探究了環境變化（碳納米材料的釋放）對細菌及菌膜的影響.利用羧基化和共價接枝方法制備了一種具有良好水分散性和穩定性的MWCNT-PEI，這種碳納米材料具有優異的抗菌性，質量濃度為20 μg·mL-1時，在1 h內幾乎可以殺死所有的銅綠假單胞菌.同時，MWCNT-PEI會影響菌膜生長，導致菌膜成熟期提前，以及成熟菌膜結構和組分發生改變（細菌數目降低，EPS分泌提高）；高濃度MWCNT-PEI會誘發菌膜的分散期提前.這些結果說明釋放于環境中的碳納米材料會對生態環境造成壓力，破壞環境微生物的生存和穩態.因此，未來大規模投產和應用納米材料前，除了分析其潛在的生物毒性，還需要系統評估其產生的環境風險.