基于聚苯胺有機半導體發展光電化學體系檢測尿素

顧鑫鑫，楊海峰，吳一萍

（上海師范大學化學與材料科學學院，上海 200234）

0 引言

光電化學（PEC）傳感器通常由光源、識別元件、信號轉換系統和信號采集系統組成［1］.它的工作原理是光電材料，通常是半導體或量子點，吸收特定波長的光后被激發，電子由價帶（VB）躍遷至導帶（CB），產生電子-空穴對；電子-空穴對與外界環境中的物質發生氧化還原反應，形成回路電流，由此確定光電信號與待測物之間的關系，實現光電檢測［2］.光電材料在PEC傳感器中至關重要，它不僅起到固定分子、產生和傳輸信號的作用，且決定著傳感器檢的檢測靈敏度.無機半導體材料是目前PEC研究中使用最廣泛的一類材料，主要包括金屬氧化物、量子點和無機半導體納米晶.這類半導體材料的優點是制備簡便、形貌可控和化學穩定性相對較好；不足之處是電子-空穴復合率高，某些半導體材料（如ZnO、CdS）具有光腐蝕特性［3-4］，且帶隙的穩定性和可調諧性較差等缺點.

血尿素氮是目前體檢的必檢項目之一，也是臨床上最廣泛應用于腎功能評估的血清標志物之一，其對心功能等方面的評估也起到一定的參考價值.成人正常血尿素氮水平約為3.2～7.1 mmol·L-1，嬰兒及兒童約為1.8～6.5 mmol·L-1.慢性腎衰竭是指各種腎臟病導致腎臟功能漸進性不可逆地減退，直至功能喪失所出現的一系列癥狀和代謝紊亂所反映出的臨床綜合征.慢性腎衰的終末期即為尿毒癥.美國國家健康和營養調查表明慢性腎臟病的患病率約為16%［5］.慢性腎臟病的主要后果之一是血液中代謝廢物的水平顯著增加，包括通常由腎臟排泄的尿素（urea）和肌酐（creatinine）［6］.在尿毒癥患者中，尿素水平可以達到健康者的10倍，尿素從1.7～8.1 mmol·L-1上升到50～70 mmol·L-1［7］，因此尿素被認為是評估尿毒癥患者毒素水平的最佳指標.目前尿素的測定方法有比色法、熒光法、氣相色譜法、酶比色法/分光光度法和高效液相色譜法［8］.然而，這些方法存在樣品前期處理耗時長、成本高和分析時間長等不足［9］.電化學方法因其儀器設備簡單、響應速度快速、檢測靈敏度高等優勢，在生物化學分析中一直占據特殊的地位.電位法和安培生物傳感是兩種常見的尿素電化學測定方法［10］.這兩種方法中，電位法因為選擇性高，被認為是可以替代傳統尿素測定方法的較好方案.在電位生物傳感方法中，尿素被固定化尿素酶水解成銨根離子（NH4

+）和碳酸氫根（HCO3-）離子，利用離子選擇性測定NH4+或HCO3-的濃度即可確定尿素的濃度.在尿素生物傳感器中，通常需要將尿素酶化學固定在不同的載體上.然而，酶的共價固定不可避免地會導致其生物活性部分喪失和穩定性變差.還有一些工作涉及繁瑣的材料制備和修飾，這會大大提高傳感器的使用成本和實際可利用性.

導電聚合物中聚苯胺（PANI）、聚噻吩和聚吡咯是一種具有類似于半導體和金屬等無機材料電性能的有機高分子材料，其制造成本低、加工性能好、機械柔性高和可功能化范圍廣，因此是無機材料理想的替代品.PANI導電性良好，且是所有導電聚合物中制造成本最低、熱穩定性最好的［11］.與其他共軛聚合物相比，PANI還具有獨特的氧化還原狀態和摻雜機理.可以向PANI祖母綠堿中摻雜酸，得到導電祖母綠鹽的結構，這兩種狀態下PANI的電導率會發生顯著變化，且該過程可逆.PANI的這種可逆特性可用于檢測許多酸性和堿性蒸汽［12］.此外，科研工作者還利用PANI可逆的氧化還原特性構建信號放大策略，實現對小分子、蛋白質和DNA的靈敏測定［13-15］.與傳統的致密薄膜相比，納米纖維形式的PANI具有更高的比表面積，生物兼容性也更好.它們可以通過共價等方式與各種有機和無機材料連接，以實現材料間的協同效應.例如，可以將單鏈DNA連接到附著在PANI納米纖維上的金納米顆粒上，以實現對金黃色葡萄球菌的檢測［15］.

為了探究PANI在PEC傳感器中的應用，通過旋涂法將PANI固定在氧化銦錫（ITO）電極表面，形成半導體膜，記為聚苯胺/氧化銦錫（PANI/ITO）.然后，在電極表面修飾聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA），通過靜電吸附的方式將脲酶（urease）固定在PANI/ITO上.PANI可質子化，在與尿素分解產物NH4+結合后，其導電狀態發生變化，從而引起自身光電流的改變.基于這一特性，構建了可以檢測尿素的PEC傳感器.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

無水乙醇、丙酮、異丙醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、PANI（翠綠亞胺基）、尿素、磷酸緩沖液（pH值為7.2～7.6）均購自Sigma公司；脲酶購自阿拉丁試劑公司；ITO導電玻璃購于深圳偉光公司南玻有限公司.實驗過程中用的水均由電阻率為18.25 MΩ·cm的超純水配制而成，所有的試劑和化學品均直接使用，未經進一步分離提純.

1.2 實驗儀器

PEC反應儀（PEAC 200A型，天津艾達恒晟科技發展有限公司）；X射線衍射儀（XRD，Rigku XRD MiniFlex，日本理學公司）；電化學工作站（CHI 440C，上海辰華儀器有限公司）；臺式勻膠機（KW-4A型，中國科學院微電子研究所）；透射電子顯微鏡（TEM，S-4800型，日本日立儀器有限公司）；紫外-可見分光光度計（UV-7504PC型，上海欣茂儀器有限公司）；干燥箱（DZF-6000，上海慧泰儀器制造有限公司）；純水儀（Milli-Q，上海淼康實業有限公司）.

1.3 制備Urease/PANI/ITO復合電極

配置8 mg·mL-1的PANI前驅液：利用電子天平稱量一定質量的PANI黑色固體粉末，加入合適體積的N-甲基吡咯烷酮，即得到8 mg·mL-1的PANI溶液；將所配置的溶液加入超聲儀中室溫超聲1 h，制得深藍色的PANI分散液.

制備PANI/ITO電極：將制備的PANI前驅液（70 μL）旋涂在預先洗凈并烘干的導電ITO玻璃表面（5 cm×5 cm）；將電極放入烘箱于45℃烘干30 min；將干燥后的電極進行第二次旋涂，并再次進行烘干處理.最后得到的電極表面有一層深藍色的透明薄膜.

制備Urease/PANI/ITO電極：配置質量濃度為3 mg·mL-1的PDDA，取70 μL均勻的滴涂在ITO表面（面積為1 cm×2 cm），于保濕盒中孵育12 h后取出，用去超純水清洗2遍，氮氣（N2）吹干.再將70 μL的脲酶（125 g·mL-1）滴涂在電極表面，孵育4 h后于搖床上用去超純水清洗3 min，N2吹干備用.

1.4 電化學阻抗（EIS）表征

在CHI 440C電化學工作站上對電極進行EIS表征，以驗證電極表面修飾是否成功.實驗條件為：三電極體系，包括Urease/PANI/ITO為工作電極，銀/氯化銀（Ag/AgCl）為參比電極，鉑（Pt）絲為輔助電極；阻抗液為5.0 mmol·L-1［Fe（CN）6］3-/4-溶液，其中含0.1 mol·L-1KCl；振幅設置20 mV，低頻設置0.1 Hz，高頻設置100 000 Hz；整個EIS實驗在安靜的環境下完成.

1.5 PEC測試

檢測系統為CHI 440C電化學工作站，激發光源為465 nm藍光，光照時間設置10 s，停滯時間設置10 s，實驗過程光源的啟動和關閉全自動化進行；采用計時電流技術進行光電檢測，Ag/AgCl為參比電極，Pt絲電極為對電極，電解液為0.01 mol·L-1Tris-HCl（pH=7.2），偏壓設置為-0.4 V.

2 結果討論

2.1 PANI膜形貌表征

圖1（a）是PANI粉末的TEM圖，可以看到本征態PANI以無定形納米顆粒的狀態存在.圖1（b）是PANI粉末XRD圖，結果顯示PANI粉末沒有特定的衍射峰，而是在25.5°附近出現了一個寬峰，這與TEM下觀察到的PANI呈無定形性納米顆粒相一致［16-18］.圖1（c）是PANI粉末的紫外可見光譜，結果顯示PANI出現2處特征吸收，分別位于340 nm和635 nm處，分別由苯環的p-p*躍遷和電子向醌環的躍遷導致［19-20］.圖1（d）是所制備的PANI/ITO電極的宏觀圖，可以看到涂敷在ITO基底表面的PANI薄膜呈透明深藍色.

圖1 PANI粉末的形貌表征.

2.2 Urease/PANI/ITO電極電化學表征

EIS譜可以有效表征電極表面的修飾過程.圖2（a）顯示了PEC傳感器構建過程中涉及的阻抗變化.阻抗圖中半圓直徑的大小可以反映電極內阻（Ret）的變化，半圓直徑越大，代表Ret越大.因為PANI為有機半導體材料，ITO基底表面涂敷上該有機半導體膜后Ret增大；脲酶為生物大分子材料，導電性差，隨著其在電極表面的固定，Ret進一步增大，電子傳輸能力再次下降.根據圖2（a）可以觀察到不斷增大的Ret，表明PANI和脲酶在ITO基底表面固定成功.圖2（b）是不同電極的光電響應，可以看到PANI膜在-0.4 V的偏壓下光電響應強，約為5 μA.該光電流為陰極光電流，代表PANI為P型半導體，光激發空穴在介帶富集，電子由外電路流入電極.另外，當PANI/ITO電極表面組裝脲酶之后，光電流顯著下降，這可能是由于脲酶的固定阻礙了部分激發光的透過，Ret增大而導致的.

圖2 Urease/PANI/ITO制備的電化學表征.（a）ITO，PANI/ITO和Urease/PANI/ITO在磷酸緩沖溶液（PB）里的光電響應（光電檢測條件為：偏壓-0.4 V，光源為450 nm左右的藍光，光照時間為10 s）；（b）不同電極的阻抗圖（阻抗液為5.0 mmol·L-1［Fe（CN）6］3-/4-溶液，其中含有0.1 mol·L-1 KCl）

2.3 檢測條件優化

為了使傳感器達到最佳性能，實驗過程中，對光源和PANI膜的厚度進行了優化.光電測定在10 mmol·L-1PB緩沖液（pH=7.2）中進行，圖1（c）的紫外可見光譜表明PANI膜在400～700 nm波段都有吸收，所以在此波段內選擇了相同功率下3種不同的光源進行優化.結果如圖3（a）所示，PANI對光源為450 nm左右的藍光響應最強.圖3（b）是不同質量濃度PANI溶液制備的PANI膜的電流-電壓（I-V）曲線，掃描電極的電壓從-0.4 V～0.2 V.在藍光的激發下，不同厚度PANI膜顯示出整流特性，當PANI溶液為8 mg·mL-1時，對應的半導體膜光電流響應趨于穩定.

圖3 PANI/ITO電極激發光源和PANI質量濃度的選擇.（a）2 mg·mL-1 PANI溶液制備的PANI膜在不同光源照射下的I-V曲線圖；（b）不同質量濃度PANI下制備的PANI/ITO電極的光電響應

圖4顯示不同質量濃度尿酶以及孵育時間對光電流的影響.由圖4（a）可知，隨著尿酶質量濃度的增加，光電流出現先增大后減小的現象.這可能是由于125 mg·mL-1的脲酶足以將所有尿素完全分解，使光電流的響應達到最大.進一步增加脲酶反而會使電極導電性變差，阻礙電子在電極表面的傳輸，引起光電流的下降.因此，在接下來的檢測過程中，脲酶的質量濃度固定為125 mg·mL-1.圖4（b）是脲酶和尿素孵育時間的優化，可以觀察到40 min后光電流達到穩定，表明尿素完全分解.因此，尿素的最佳孵育時間為40 min.

圖4 Urease/PANI/ITO電極在（a）不同尿酶質量濃度和（b）尿素和脲酶不同孵育時間下的光電響應（光電檢測條件為，偏壓-0.4 V，光源為450 nm左右的藍光，光照時間為10 s）

2.4 尿素檢測

確定好最優檢測條件后，利用Urease/PANI/ITO電極對不同質量濃度的尿素進行了測定.由于PANI的自然可逆去質子化過程，PANI的導電翠綠鹽（ES）形式會轉化為半導體翠綠堿（EB）形式，在這個過程中PANI由于本身狀態的改變從而帶來導電性的變化.檢測過程中尿素會在脲酶的作用下分解產生NH4+，通過反應方程式（1）可以推測得到，產生的NH4+會將PANI中EB形式質子化為ES形式.根據上述分析可知，光電流響應與尿素的濃度呈正相關性，尿素濃度越高在脲酶作用下會產生的NH4+也越多，那么釋放的質子將PANI的亞胺質子化，更多轉換為ES形式，帶來較強的光電流信號［21］.

圖5（a）為最優實驗條件下此生物傳感器對不同物質的量濃度尿素的光電響應.可以看到隨著尿素物質的量濃度的增加，光電流逐漸升高.圖5（b）是尿素物質的量濃度（c）與光電流強度變化（ΔI）的擬合圖，可以發現兩者在10-3～10-8mol·mL-1范圍內呈良好的線性關系，線性方程為ΔI=2 166+2 52lgc，相關系數的平方（R2）=0.981，最低檢測限為1.8×10-9mol·mL-1.

圖5 Urease/PANI/ITO電極在（a）不同物質的量濃度尿素的光電響應（A→G分別為：0，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4，10-3 mol·L-1），以及（b）光電流變化與尿素濃度間的線性關系（光電檢測條件為，偏壓-0.4 V，光源為450 nm左右的藍光，光照時間為10 s）

2.5 傳感器重現性、穩定性和選擇性考察

此外，還對傳感器的重現性、穩定性和選擇性進行了考察.圖6（a）是不同批次制得的PANI/ITO和Urease/PANI/ITO電極的光電響應，發現不同批次之間光電流強度差異不大，表明該傳感器重現性良好.另外，通過連續開/關燈約400 s，得到如圖6（b）所示的光電響應結果，發現經過20多個循環之后，無論是PANI/ITO還是Urease/PANI/ITO電極，光電流仍然保持平穩狀態，該生物傳感器展現了優異的光穩定性.此外，對該傳感器的特異性也進行了考察，選擇了4種可能會對尿素測定帶來干擾的物質，包括抗壞血酸（ascorbic acid）、肌酐、胱氨酸（cystamine）和葡萄糖（glucose），考察了傳感器對它們的響應，結果如圖6（c）所示，發現雖然這些干擾物的濃度高達0.01 mol·L-1，但它們在電極表面的響應與背景接近，表明傳感器選擇性良好.脲酶對尿素特異性催化降解，保證了該傳感器的特異性.

圖6 傳感器重現性、穩定性和選擇性考察.（a）不同批次的PANI/ITO和Urease/PANI/ITO電極在PB緩沖溶液（pH=7.2）中的光電響應；（b）Urease/PANI/ITO電極穩定性考察；（c）Urease/PANI/ITO電極對尿素（10-7 mol·L-1）、抗壞血酸（0.01 mol·L-1）、肌酐（0.01 mol·L-1）、胱氨酸（0.01 mol·L-1）、葡萄糖（0.01 mol·L-1）的響應.

3 結論

基于制備的Urease/PANI/ITO復合電極，利用PANI的半導體屬性和可質子化特性，發展了可選擇性檢測尿素的PEC法.該傳感器以脲酶為識別元件，利用脲酶可以特異性降解尿素產生NH4+導致PANI質子化，從而改變其導電狀態，最終引起光電流的變化，建立尿素濃度和光電流強間的相關性，從而實現對尿素的快速、靈敏和特異性的檢測.與其他方法比，該傳感器成本低效益高，且具有操作簡單的優勢.