魚藤素通過AKT/FoxO1信號通路誘導胃癌細胞凋亡的作用機制

李 黎 孫 川 劉 莉 鄧 潔 晏 菲 魏武杰

(湖北省第三人民醫院腫瘤內科，武漢，430000)

胃癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，在我國各種惡性腫瘤中發病率居第2位，是全球發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一[1-2]。一般情況下胃癌發生早期無明顯癥狀，易被忽略，因此胃癌早期診斷較為困難，給臨床治療帶來了極大困難[3]。臨床上胃癌治療多以化療或手術切除為主，化療不良反應大，同時對患者的身心影響大，因此尋求更加安全有效的藥物，減少藥品不良反應，是目前胃癌治療的一個難題。近年來研究結果表明，中藥活性成分毒性低，作用靶點多，對于惡性腫瘤的防治作用備受關注，顯示出了巨大的潛力。

魚藤素(Deguelin，De)是植物中常見的魚藤酮類化合物，藥理學研究顯示具有顯著的殺蟲、抑制生長發育的作用[4-5]。研究表明，魚藤素對癌癥的抵抗作用顯著，尤其是抑制肺癌、舍鱗癌和肝癌等惡性腫瘤有明顯作用[6-8]。相關研究顯示，魚藤素可對蛋白激酶(AKT)進行選擇性抑制，從而對癌細胞起到一定抑制作用。AKT信號通路的活化在胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤發生過程中具有重要作用。Ho等[10]研究表明，在胃癌腫瘤中AKT基因過表達。但是，目前尚未有研究表明魚藤素可以抑制胃癌細胞基因從而導致癌細胞死亡。因此，本研究采用人體胃癌細胞進行實驗，探索魚藤素作用于胃癌細胞的機制，為防治胃癌提供嚴謹科學的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 SGC-7901人類胃癌細胞，來自于中科院生物化學與細胞生物學研究所，許可證：SYXK(京)2016-0001，干冰運輸的凍存細胞，液氮保存，長期有效。

1.1.2 藥品 魚藤素，上海源葉生物科技有限公司，批號：522-17-8，純度>95%。

1.1.3 試劑與儀器 AKT過表達質粒載體(漢恒生物科技有限公司，批號：12390912)DMEM高糖培養基(Gibco公司，美國，批號：12491-015)、胎牛血清(Gibco公司，美國，批號：10099-14-FBS)、青-鏈霉素(Gibco公司，美國，批號：15070063)等，CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所，日本，批號：CK04)，叉頭框蛋白O1(Forkhead Box O1，FoxO1)、B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)mRNA、β-肌動蛋白(actin)上下游引物和探針(InvitrogenTM公司，美國，批號：12010121)，熒光定量PCR試劑(DBI公司，批號：16051012)，FoxO1兔單克隆抗體(美國CST公司，美國，批號：2880)、β-actin(美國CST公司，美國，批號：4970)兔單克隆抗體(美國CST公司，美國，批號：14021202)、p-AKTThr308兔單克隆抗體(美國CST公司，美國，批號：13038)、辣根過氧化物酶-羊抗兔IgG二抗(美國CST公司，批號：7074)、Bcl-2兔單克隆抗體(美國CST公司，美國，批號：4223)等，BCA的蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，美國，批號：23227)、RNA提取試劑(Thermo Fisher Scientific公司，美國，批號：23209)、超敏化學發光液(Thermo Fisher Scientific公司，美國，批號：34580ECL)、細胞蛋白提取試劑(Thermo Fisher Scientific公司，美國，批號：78501)，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠快速制備試劑盒(EpiZyme Scientific公司，美國，批號：18D250)，研究用水為超純凈水，其余實驗試劑均符合實驗室要求。

CO2培養箱(三洋公司，日本，型號：MCO-18AC)；酶標儀(Bio-Rad公司，美國，型號：Bio-rad xMark)、細胞計數器(Bio-Rad公司，美國，型號：TC20)、實時定量PCR儀(美國伯樂公司，美國，型號：CFX96)、蛋白轉膜儀(美國伯樂公司，美國，型號：全能型)，離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司，型號：CTK120R)、分析天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型號：MS-TS)，化學成像分析系統(Syngene公司，英國，型號：GBOX)、倒置顯微鏡(Olympus Corporation，日本，型號：CKX31)、恒溫水浴鍋(武漢格萊莫檢測設備有限公司，型號：HH-S4)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將SGC-7901人類胃癌細胞植入杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle Medium，DMEM)高糖培養基中，將溫度調至37 ℃，CO2濃度調至5%進行培養，觀察胃癌細胞生長發育狀態。本研究已獲得醫學倫理委員會審核準許(倫理審批號：HBSDSRMYY201208063326)。

DMEM高糖培養基的配置：10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL。

1.2.2 魚藤素溶液配置 將1 mL DMSO與39.4 mg魚藤素相溶取得濃度100 mmol/L的母液作為對照，儲存于-20 ℃的環境中。取一定量母液在培養基中稀釋至10 mmol/L的濃度作為工作液，再用微孔為0.22 μm的濾膜過濾。

1.2.3 分組與魚藤素給藥濃度篩選 選取處于生長期的細胞，加入胰酶消化液可制得細胞懸液，并用細胞計數器對其計數。在96孔板中將細胞懸液鋪勻，使其每孔體積為100 μL，數量達到5 000個，將孔板分為3組，分別為對照組、空白組、濃度不同藥物組，并在每組設置6個復孔。3個對照組中分別加入含魚藤素(10、20、40、60、80、100 mol/L)的培養基，給藥后分別在24 h和48 h時向孔中添加10 μL CCK-8試劑，并繼續培養2 h。使用酶標儀進行吸光度測定后可算出細胞的成活度，重復上述實驗步驟。細胞成活率(%)=(A給藥-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

He didn’t ask for a meal, but a drink of water. She could see he was hungry.Soon she brought him a large glass of milk, “How much do I 2)owe you?” he asked.

1.2.4 分組與給藥 1)選擇對數生長期的細胞種植于100 mm培養皿中，并分成對照組、20 μmol/L魚藤素組和40 μmol/L魚藤素組，24 h后取細胞進行檢測，并反復多次進行實驗。2)取對數生長期細胞，接種于100 mm培養皿中，設對照組、模型組(AKT過表達載體轉染)及魚藤素給藥組(AKT過表達載體轉染后給予相應濃度魚藤素干預)，不同劑量的魚藤素給藥作用24 h后，收集細胞用于檢測分析，進行重復實驗。

1.2.5 魚藤素對SGC-7901細胞中AKT/FoxO1信號通路相關蛋白表達的影響 SGC-7901胃癌細胞按1.2.4的1)中的方法進行分組給藥，采用蛋白提取試劑的方法在給藥結束后進行蛋白提取，用BCA試劑盒對蛋白含量進行測定。先將蛋白樣品進行電泳分離，再將其轉至厚度為0.45 μm的聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上，將5%脫脂牛奶進行1 h的密封，Bcl-2等一抗(1∶1 000)、FoxO1、p-AKTThr308在搖床溫度為4 ℃的情況下過夜，使用洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)進行3次清洗工作，每次工作10 min，使用G:BOX成像分析系統在顯色之后獲得條帶，將β-actin作為內參。進行灰度值分析時采用Image J圖像軟件進行分析。

1.2.6 魚藤素對AKT基因轉染SGC-7901胃癌細胞中AKT/FoxO1信號通路相關蛋白表達的影響 SGC-7901細胞按1.2.4的2)中方法進行分組給藥，采用蛋白提取試劑的方法在給藥結束后進行蛋白提取，并用BCA試劑盒對蛋白含量進行測定按1.2.5中的方法檢測p-AKTThr308、FoxO1、Bcl-2等蛋白的表達。

1.2.7 魚藤素對FoxO1、Bcl-2、Bax mRNA表達的影響 SGC-7901胃癌細胞按1.2.4的2)中方法進行分組給藥，給藥結束后運用RNA提取試劑盒提取GC-7901胃癌細胞中的RNA，取RNA2 μg和50 mmol/LOligo-dt1 μL混勻，于65 ℃水浴5 min后馬上放于冰上進行降溫，并向其加入4 μL的5×RT緩沖液、1 μL的莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，M-MLV)，將2 μL的10 mmol/L脫氧核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside Triphosphate，dNTP)和焦碳酸二乙酯(Diethyl Pyrocarbonate,DEPC)水補足反應體系后進行混合、離心，離心半徑20 cm，轉速30 000 r/min，離心10 min。PCR儀上操作：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min；PCR條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，73 ℃延伸45 s，擴增30個循環，以β-actin為內參，取PCR擴增產物10 μL，于1%瓊脂糖凝膠中電泳，并在此過程中使用凝膠成像分析儀進行全程拍攝，提取所有GAPDH吸收度和待測基金的比值，得到引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 魚藤素濃度和作用時間對SGC-7901細胞成活率的影響 SGC-7901胃癌細胞成活率與魚藤素給藥濃度、作用時間成反比，即魚藤素用藥濃度越大、作用時間越長，SGC-7901胃癌細胞成活率越低，其中40 μmol/L的魚藤素作用24 h和48 h后的SGC-7901胃癌細胞成活率分別為78.2%和64.6%，魚藤素具有誘導癌性細胞SGC-7901凋亡，抑制其增殖的作用。其中魚藤素用藥濃度為20 μmol/L和40 μmol/L，作用24 h為最佳給藥方案。見圖1。

圖1 魚藤素濃度和作用時間對SGC-7901細胞成活率的影響

圖2 魚藤素對SGC-7901胃癌細胞中AKT/FoxO1信號通路相關蛋白表達的影響

2.3 魚藤素對AKT基因轉染SGC-7901胃癌細胞中AKT/FoxO1信號通路相關蛋白表達的影響 與對照組比較，在AKT基因轉染的模型組中SGC-7901胃癌細胞的Bcl-2和p-AKTThr308等蛋白表達水平有上升趨勢，而FoxO1的蛋白表達水平呈下降趨勢,差異均有統計學意義(均P<0.01)。經過20、40 μmol/L魚藤素給藥作用24 h后均能夠降低p-AKTThr308、Bcl-2等蛋白的表達水平，升高FoxO1蛋白的表達水平，與AKT基因轉染的模型組比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見圖3。

圖3 魚藤素對AKT基因轉染SGC-7901胃癌細胞中AKT/FoxO1信號通路相關蛋白表達的影響

2.4 魚藤素對FoxO1、Bcl-2、Bax mRNA表達水平的影響 與對照組比較，AKT基因轉染的模型組SGC-7901胃癌細胞中Bcl-2、Bax mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)，FoxO1 mRNA表達水平降低(P<0.01)；與模型組比較，經過20、40 μmol/L魚藤素給藥作用24 h后均能夠降低Bcl-2 mRNA的表達水平，升高FoxO1、Bax mRNA的表達水平，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 魚藤素對FoxO1(左)、Bcl-2(中)、Bax(右)mRNA表達水平的影響

3 討論

胃癌作為臨床中常見的消化道惡性腫瘤，具有較高的致死率與并發癥，對患者的生命健康有極大的威脅[11]。隨著近幾年醫療科技手段的不斷進步與普遍使用，越來越多的方法可以用于防治惡性腫瘤的發展，現階段主要研究方向為靶向調節。研究表明，原癌基因AKT經常在胃癌中過表達或激活[12-13]。同時通路下游的分子AKT可通過磷酸肌醇-3激酶進行調節，可以有效抑制糖脂代謝、細胞生長、惡性腫瘤和胰島素信號的形成，對于腫瘤的發生、發展具有重要作用[14-15]。Yu等[16]研究表明，SGC-7901胃癌細胞中AKT信號通路被激活，提示AKT信號通路在胃癌發生發展中可能具有重要作用。FoxO1作為AKT信號通路下游的一個轉錄調節因子，不僅對惡性腫瘤的形成與細胞增殖具有明顯的作用，還對細胞的新陳代謝、發育、分裂分化均有一定的作用。實驗結果顯示，影響胃癌細胞的因素分為多種，而FoxO1的表達對腫瘤細胞的發育、凋亡有著直接關系[17-18]。其中抑制腫瘤細胞凋亡的重要基因之一是Bcl-2，而可引起人體細胞加快死亡的重要基因為Bax，當Bax基因過表達，則會降低Bcl-2基因的保護作用，從而使細胞凋亡速度加快。

陳立加等[19]研究發現，胃癌細胞SGC7901/VCR在不同濃度魚藤素下的活力受到不同程度的抑制作用，并濃度、時間具有梯度依賴性。魚藤素可能是對抗胃癌多藥耐藥以及細胞活力有影響，可作為一種潛在藥物深入研究。

魚藤素是AKT信號通路的抑制劑，具有顯著的抗癌活性。AKT/FoxO1信號通路在腫瘤抗凋亡及增殖過程中發揮著重要作用[20]。本實驗在體外以SGC-7901胃癌細胞作為研究對象，考察魚藤素對SGC-7901胃癌細胞中p-AKTThr308、FoxO1、Bcl-2等蛋白表達的調節作用，同時運用AKT過表達載體轉染使SGC-7901胃癌細胞中AKT表達水平升高，然后再給予魚藤素作用，考察魚藤素對AKT/FoxO1信號通路相關基因表達的影響。研究結果表明魚藤素能夠抑制p-AKTThr308蛋白的表達，升高FoxO1的表達從而抑制Bcl-2的表達，升高Bax的表達水平從而誘導SGC-7901胃癌細胞凋亡[21-22]。

綜上所述，魚藤素能夠通過AKT/FoxO1信號通路調節凋亡相關因子的釋放從而誘導SGC-7901胃癌細胞凋亡，對于胃癌的防治具有一定的作用。