FEN1/PCNA免疫組化雙染在老年結直腸癌患者中的表達及其與臨床病理特征的相關性

劉曉梅 顧麗 李明

(1蘇州衛生職業技術學院，江蘇 蘇州 215009；2蘇州市立醫院病理科)

結直腸癌(CRC)目前已分別成為世界上女性和男性第二和第三常見的癌癥〔1～5〕。生物標志物在CRC患者的檢測、治療和危險等級中發揮著重要作用〔6〕。其中，p53基因、鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)和鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(BRAF)的突變、磷酸酶張力蛋白基因(PTEN)和ezrin蛋白的表達、染色體18q雜合性缺失(18qLOH)、微衛星不穩定性(MSI)已被證明是CRC患者的預后因素〔1，2，7～10〕。然而，這些生物標志物數量少到不足以建立完整的風險分層體系，仍需要更多具有預后價值的生物標志物來評估CRC患者預后。人皮瓣內切酶(FEN)1是一種結構特異性的DNA核酸酶〔11〕。它在DNA復制和DNA修復途徑如堿基切除修復(BER)和聚合酶α錯誤編輯中、岡崎片段的成熟中至關重要〔12〕。增殖細胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶 δ 的輔助蛋白,參與調節DNA的合成。在人類腫瘤,FEN1過表達已被廣泛報道，并且FEN1表達對乳腺癌和肺癌有預后價值〔13，14〕。然而，FEN1、PCNA蛋白在老年人CRC表達狀態及預后價值尚不清楚。本研究分析FEN1、PCNA 在老年人CRC組織中定位及蛋白表達及其與臨床病理特征和預后的相關性。

1 資料與方法

1.1資料 蘇州市立醫院2003年1月1日至2007年12月31日年齡60歲及以上住院患者手術切除CRC標本68例(收集74例，其中6例染色時掉片除去)，鄰近正常組織(據腫瘤5 cm以上)11例。隨訪時間截止至2012年12月30日。患者術前均未進行放療和化療，標本均經兩位病理專家閱片證實。排除了合并其他惡性腫瘤；心、肝、腎等重要器官嚴重損傷及臨床資料不完整者。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。年齡中位數為72.0歲。收集所有患者臨床病理參數。

1.2試劑 免疫組化一抗、二抗及免疫組化雙染檢測試劑盒均購自基因科技有限公司，FEN1抗體(Catalog Number:GTX70185)，PCNA抗體(AF1363)。免疫組化雙染檢測試劑盒：GTVisionTM。

1.3組織芯片的構建 常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，石蠟組織標本HE染色后，在顯微鏡下標記腫瘤或正常組織。每個蠟塊取二塊組織芯點，制成10行×16列芯片蠟塊(其中每一腫瘤組織取材2芯點)，組織芯直徑為1.6 mm。

1.4免疫組化染色及結果判定 免疫組化雙染是通過二種不同種屬的二抗系統，二種不同種屬的抗體(一抗為FEN1、PCNA)及不同顏色的顯色系統〔二氨基聯苯胺(DAB)和PermaRed〕，在一張組織切片(芯片)中同時檢測二種抗原的表達情況。按照免疫組化雙染試劑說明書進行染色操作，實驗同時有公司提供的陰性、陽性對照。FEN1抗體稀釋度為1∶100；PCNA抗體為工作液，FEN1抗體染色陽性者主要在細胞質，少量在細胞核，棕黃色為陽性信號。PCNA抗體染色陽性者在細胞核，為紅色。結果判定：200×顯微鏡下有棕黃或紅色即為陽性，無為陰性。

1.5統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗和采用Spearman等級相關分析。FEN1/PCNA蛋白表達K-M分析患者預后。

2 結 果

2.1FEN1/PCNA蛋白雙表達 CRC組織FEN1/PCNA蛋白雙表達：FEN1蛋白表達主要定位在細胞質，棕色；PCNA蛋白表達在細胞核，紅色。如圖1示：腫瘤腺體的FEN1/PCNA雙表達于高分化腺癌和低分化腺癌中；而黏液性腺癌陰性表達及正常結直腸組織不表達與腺癌雙表達。

圖1 CRC組織中FEN1/PCNA蛋白雙表達(DAB)

2.2FEN1蛋白的表達 CRC組織中FEN1蛋白陽性表達率〔77.9%(53/68)〕顯著高于正常組織〔8.2%(2/11)，χ2=11.000、P=0.018〕；FEN1蛋白可見于CRC組織中單獨表達(圖2)，而正常結直腸黏膜組織普遍呈低表達，僅有1例局部略微表達。

2.3PCNA蛋白的表達 CRC組織中陽性PCNA蛋白陽性表達率為〔30.9%(21/68)〕，正常組織中未見表達。PCNA蛋白陽性表達均伴有FEN1蛋白陽性表達(圖1)。

2.4CRC組織中FEN1與PCNA蛋白表達與臨床病理特征的關系 FEN1、PCNA陽性表達與年齡、性別、腫瘤直徑、病理大體分型、腫瘤TNM分期、手術方式、分化程度、浸潤深度等均無關，而與其淋巴結轉移、腫瘤組織學分級(僅FEN1)相關(P<0.05)，見表1。

2.5CRC組織中FEN1和PCNA蛋白表達的相關性 53例FEN1陽性CRC中PCNA陽性21例，15例PEN1陽性者PCNA亦不表達。FEN1和PCNA表達呈正相關(r=0.356，P=0.003)。

2.6CRC組織中FEN1和PCNA蛋白表達的Kap-lan-Meier分析 隨訪時間6～96個月，FEN1/PCNA蛋白雙表達與患者生存時間無關(χ2=1.372，P=0.241)，見圖3。

表1 FEN1、PCNA蛋白陽性表達與結直腸癌臨床病理參數的關系(n)

圖3 FEN1和PCNA蛋白表達的Kaplan-Meier生存函數

3 討 論

FEN1是一種結構特異性的多功能核酸酶具有缺口內切核酸酶(GEN)的活性。GEN活性在凋亡 DNA 片段化中起著至關重要的作用，而FEN1/PCNA 復合物的相互作用可抑制GEN活性并促進 FEN 活性。當細胞遭受內源性或外源性 DNA 損傷如紫外線照射時，FEN1會被磷酸化使其從PCNA上解離，推測PCNA是影響DNA復制速率和準確性的信號樞紐并調控DNA損傷修復〔15〕。PCNA與200多種蛋白質相互作用，作為DNA復制和修復過程的基本介質〔16，17〕。因此，它已被確定為治療由DNA異常復制定義的疾病的關鍵治療靶點，包括人類多種癌癥。本實驗結果顯示：FEN1/PCNA呈結合狀態在同一癌細胞中的蛋白表達均陽性與腫瘤淋巴結轉移密切相關，理論上是否可以推測FEN1/PCNA復合物抑制了GEN活性而影響了對DNA損傷修復的調控作用。本文提示PCNA和FEN1均在增殖活躍的細胞中表達較高。本實驗Lu等〔13〕及He等〔14〕研究證實的FEN1表達水平在乳腺癌和肺癌組織中高表達具有預后價值相同。 而這些結果與 FEN1 作為抑癌因子〔18〕的結果相反：癌癥的生長和發展依然需要FEN1。比較好的解釋是因為FEN1在DNA復制中起重要作用，所以需要高水平的FEN1來支持癌細胞的過度增殖。與癌組織中FEN1的過表達一致，與匹配的正常組織相比，蛋白質水平上的 FEN1表達增加。FEN1可以兩種非常不同的方式促進癌癥：①基因突變可導致基因組不穩定，并引發惡性轉化；②基因的過表達賦予腫瘤生長優勢，為了響應后一種促進癌癥的方法，已建議將 FEN1作為癌癥的生物標志物及治療靶標〔19～22〕。但是，像其他目前的生物標志物或化學療法一樣，FEN1抑制劑可能充滿不確定性或副作用，并且有可能傳播甚至引發新的癌癥。應繼續增加生物標志物或新藥，并最終希望有新的具有診斷、預后及藥物遞送機制。