EGFL7、MMP-9和VEGF在老年腎透明細胞癌中陽性表達及臨床意義

趙序雯 劉偉 張新東 肖智

(濟寧醫學院附屬滕州市中心人民醫院，山東 滕州 277599)

腎腫瘤的發病率及死亡率占全身腫瘤的2%左右，其中腎細胞癌可占85%左右，被認為是我國泌尿外科惡性腫瘤中一類非常常見的惡性腫瘤疾病，但在當前臨床研究中，關于腎癌的發病機制尚未明確〔1〕。據流行病學專家發現腎癌的發生發展可受到多種因素影響，如吸煙、肥胖、職業、基礎疾病、飲酒及家族史等〔2〕。也有報道發現，由于惡性腫瘤的侵襲及轉移本身屬于一個較為復雜的病理過程，且該過程與細胞外基質、基底膜降解等多種過程及環節有關，且新生血管的形成與腫瘤的發生發展、轉移等具有密切關聯性〔3〕。在多種促血管生長因子中，表皮生長因子樣結構域(EGFL)7被認為是促進血管管腔形成的必需因子，可在血管管腔形成及功能中發揮較為重要的作用；血管表皮生長因子(VEGF)被認為是最為重要的一種血管生成正性因子，可有效促進調整血管內皮的增殖過程；而基質金屬蛋白酶(MMP)本身作為一種可在惡性腫瘤中呈現出較高表達水平的物質，在惡性腫瘤細胞生長及增殖過程中過度表達〔4,5〕。本文擬分析EGFL7、MMP-9和VEGF在老年腎透明細胞癌中的陽性表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取濟寧醫學院附屬滕州市中心人民醫院2019年4月至2021年4月收治的老年腎透明細胞癌患者80例的臨床資料，均簽署知情同意書，其中男42例，女38例，年齡60～72歲，平均(65.24±4.12)歲，均接受根治性腎切除術治療，選取切除下來的腎透明細胞癌組織樣本進行研究，全部患者按照TNM分期分為Ⅰ期組(n=14)、Ⅱ期組(n=19)、Ⅲ期組(n=27)、Ⅳ期組(n=20)，同時按照Fuhrman分級分為1級組(n=15)、2級組(n=21)、3級組(n=30)及4級組(n=14)。TNM分期指腫瘤原發灶的情況，隨著腫瘤體積的增加和鄰近組織受累范圍的增加，依次用T1～T4來表示〔6〕。Fuhrman分級的確定方法是用顯微鏡觀察癌細胞，根據癌細胞的核形態做分級，如果異型性越高，分級就越高，預后越差。具體分級方法：Ⅰ級為高分化；Ⅱ級為高分化；Ⅲ級為中分化；Ⅳ級為低分化(未分化)〔7〕。

1.2組織標本選取方法 在手術過程中使用解剖刀在癌腫部位取出300 mg癌組織后，將癌組織放置在標記好的無RNA酶凍存管中保存15 min，隨后放置-80℃冰箱中保存待用。

1.3免疫組織化學染色方法 采用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)法測量EGFL7、MMP-9和VEGF。具體操作方法：選擇含有腫瘤的組織標本用石蠟切片固定，烤片后，使用二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水；3%過氧化氫孵育，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌以達到阻斷內源性過氧化物酶的目的；使用微波抗原修復，并向其中分別加入正常羊血清及過氧化物酶溶液，孵育后加入一抗4℃孵育過夜，之后加入生物素標記二抗及辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素鏈霉菌抗生物素溶液，最后給予二氨基聯苯胺(DAB)染色，蘇木素復染，常規脫水及封片處理。采用PBS代替一抗作為陰性對照組。該實驗中所涉及的免疫組化試劑盒及相關試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，主要儀器光學顯微鏡、電熱恒溫培養箱、組織超薄切片機購自上海躍進醫療器械廠。

1.4結果判讀 EGFL7、MMP-9和VEGF陽性染色將腫瘤細胞胞質內或包膜出現棕黃色顆粒沉著判斷為陽性，由兩位病理科醫生獨立完成判斷。通過利用高倍鏡下半定量法判斷每張切片內單個視野內染色陽性細胞百分比，陽性細胞≤10%計為0；陽性細胞10%～24%計+；25%～49%計為；50%～74%計為；≥75%計為〔8〕。

1.5統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件進行χ2檢驗、Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1EGFL7、MMP-9和VEGF在腎透明細胞癌中表達情況 在Fuhrman分級4級的腎透明細胞癌中，EGFL-7在胞質中呈現高表達，尤其在毛細血管形成區域表達較高；MMP-9在胞質中出現淡黃色或棕色顆粒；VEGF也在毛細血管周圍的腫瘤細胞胞質和胞膜中高表達。見圖1。

圖1 EGFL7、MMP-9和VEGF在腎透明細胞癌中表達情況(DAB，×100)

2.2不同TNM分期下EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率對比 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期組分別與Ⅰ期組相比，EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率較高，Ⅲ、Ⅳ期組分別與Ⅱ期組相比陽性率較高，Ⅳ與Ⅲ期組相比陽性率較高(P<0.05)。見表1。

2.3不同Fuhrman分級EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率對比 2、3、4級組分別與1級組相比，EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率較高，3、4級組分別與2級組相比陽性率較高，4與3級組相比陽性率較高(P<0.05)。見表1。

2.4EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率與TNM分期、Fuhrman分級相關性 腎細胞癌中EGFL7、MMP-9和VEGF陽性表達率隨著TNM分期(r=0.887、0.657、0.914)、Fuhrman分級(r=0.954、0.687、0.776)的升高而增加，且呈現出了明顯的正相關性(P<0.05)。且EGFL7與MMP-9、VEGF呈正相關(r=0.579、0.812，P<0.005)，MMP-9與VEGF呈正相關(r=0.745，P<0.05)。

表1 不同TNM分期及不同Fuhrman分級EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率對比〔n(%)〕

3 討 論

報道指出，無論是原發性腫瘤還是繼發性轉移瘤在正常生長及擴散過程中均會依賴血管的生長及發展，且腫瘤的持續惡化及生長也必須依賴新生血管的生成，方可提供重組的營養及氧氣，并由此快速將產物運輸，對腫瘤的生長發揮促進作用，同時也為腫瘤細胞進入體內的循環提供基礎〔9〕。腫瘤血管生成是一個較為連續且復雜的過程，且腫瘤體內的新生血管是由于各種血管因子誘導及相互作用形成，為此，對腎癌組織中的血管生長因子進行研究具有重要臨床意義〔10〕。

VEGF被認為是最強的血管生長因子，在內皮細胞系統內可特異性作用在內皮細胞生長因子受體上，并對內皮細胞的增殖及腫瘤血管的生長可產生較強的刺激作用，且幫助腫瘤脫落后可順利進入血管內，而對腫瘤的生長、浸潤及轉移產生一系列推動作用〔11〕。本研究結果說明當VEGF的陽性表達率升高后，可通過作用在內皮細胞的受體上而發揮較為明顯的生物學功能，并由此誘導并加重內皮細胞的增殖及遷移，促進腫瘤血管生成〔12〕。

EGFL7作為一種在近年來新發現的新基因，可特異性表達在內皮細胞系統上，研究指出，EGFL7的作用在于能夠對血管內皮遷移產生較為顯著的促進作用，同時還可對內皮細胞黏附進行有效調節，并能夠對幫助構建血管床結構，有效維持血管穩定性〔13〕。另外，有研究顯示，由于腫瘤組織中具有較為豐富的血液供應，EGFL7也會大量存在于腫瘤新生血管內皮細胞內〔14〕。本研究結果顯示，腎癌中若表現出了EGFL7高表達情況，說明此時腫瘤血管不斷形成，EGFL7也有效維持了腫瘤血管的穩定性。

MMPs是一類鋅離子和鈣離子依賴的蛋白酶家族，該家族中有24種類型，可靶向ECM中眾多蛋白并使其降解，且各種MMP間具有一定底物特異性〔15〕。正常情況下，MMPs能夠降解細胞外基質和基膜，和組織金屬蛋白酶抑制劑一起調控細胞外基質的降解，但調控機制失衡會使細胞外基質過度降解，本身在介導腫瘤血管新生、侵襲及轉移過程中可發揮較強作用〔16〕。其中MMP-9被認為是腫瘤發生發展的一類潛在生物標志物，同時也被認為是細胞外基質重塑的關鍵效應物質。本結果提示，MMP-9的平衡被打破后，腫瘤的生長及血管惡化也會相應進展〔17〕。另外，本研究結果顯示，EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率三者之間也呈現出了明顯的兩兩正相關性，但相互之間的作用機制尚未明確，推測可能出現此結果的原因是由于EGFL7的高表達可加快腫瘤血管生成及腫瘤體積增大，在腫瘤體積不斷增大的期間，對營養的需求量也明顯升高，同時需要更多的新生血管為其提供充分養分，此時VEGF等其他促血管生長因子的表達量就會生長，MMP-9的調控機制也會失衡，由此對內皮細胞產生刺激作用而導致其大量增生，加之內皮細胞持續聚集而形成血管芽，旨在維持腫瘤血管的穩定性〔18〕。

綜上，老年腎透明細胞癌組織中EGFL7、MMP-9和VEGF與疾病的不同分期及分級之間具有相關性，三者的高陽性表達可能協同了腫瘤新生血管的生成及疾病的惡化進展。