GDF-5對大鼠骨髓間充質干細胞增殖、遷移的影響及相關作用機制

胡廣 關智宇 張開偉

(貴州中醫藥大學第一附屬醫院骨科，貴州 貴陽 550001)

骨髓間充質干細胞(BMSC)有多向分化、自我更新潛能,可以分化為多種間質組織〔1〕。在哺乳動物的骨髓基質中發現BMSC有分化形成骨、脂肪、神經、軟骨、成肌細胞等多種分化潛能的細胞亞群〔2〕。BMSC來源豐富，容易分離，對供體影響較少，在一定條件下可轉化為軟骨細胞〔3〕。目前認為是骨組織工程最重要的種子細胞來源，且具有免疫調節功能，通過細胞間的相互作用、產生細胞因子抑制T細胞的增殖和其免疫反應，從而起到免疫重建的功能〔4,5〕。BMSC可以分化成血管平滑肌細胞、心肌細胞、內皮細胞。本文旨在探討GDF-5對大鼠骨髓間充質干細胞增殖、遷移的影響及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 研究細胞：分離大鼠BMSC并進行培養。主要試劑與細胞：SPF級SD大鼠(河南中醫藥大學，SYXK(豫)2020-0009)；高糖DMEM培養基(北京凱瑞基生物科技有限公司)；胎牛血清(武漢益普生物科技有限公司)；PCR試劑盒(上海彩佑實業有限公司)；流式細胞儀(基爾頓生物科技(上海)有限公司)；Transwell小室(上海子起生物科技有限公司)；磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)一抗(北京百奧萊博科技有限公司)；噻唑藍(MTT)試劑(艾美捷科技有限公司)；蛋白激酶B(Akt)一抗(上海莼試生物技術有限公司)，本研究獲醫院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1BMSC分離 無菌條件下分離大鼠脛骨、股骨，用眼科剪從股骨及脛骨的干骺端切開骨髓腔，將骨髓腔用含肝素的DMEM培養液進行沖洗。吸管重復吹打后，1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入DMEM培養基4 ml重懸，密度為1 073 g/ml的PercoⅡ分離液中滴加細胞重懸液按1∶1比例，1 500 r/min離心30 min，取乳白色云霧狀的單個核細胞層，添加到DMEM培養液稀釋混勻，1 500 r/min離心5 min，沖洗2～3次，將多余的脂肪細胞和組織液去除。用DMEM培養基且含有雙抗的10%胎牛血清進行重懸細胞，細胞密度為20×105個/cm2接種于培養瓶內，在37℃、飽和濕度為5%的孵箱內培養。

1.2.2慢病毒載體構建 GDF-5表達抑制的慢病毒載體構建及測定患者GDF-5的序列查找和設計(由廣州易錦公司完成)。GDF-5引物序列：上游：5′-ATGGTACCTTCGCTGCTACGGCCTTTCTCT-3′；下游：5′-TATCTAGAGGGGTAGTCTCTGGATGTGCCA-3′組成。目標基因探針和內參基因探針均為5′端采用FAM報告熒光標記,3′端采用TAMRA淬滅熒光標記。PCR體系:4.5 μl反轉錄產物，0.5 μl TaqMan microRNA assay(5×)，5.0 μl TaqMan Mix。PCR反應條件:95℃預熱5 min;95℃ 15 s,60℃ 1 min,循環40次。將細胞分為：對照組、下調組、上調組，其中對照組細胞不做任何處理，對下調組、上調組按照Li-pofectamine2000說明書分別進慢病毒滴度轉染miR-639 mimics和miR-inhibibor。

1.2.3細胞培養 用移液槍吸取200 μl BMSC懸液置于96孔細胞培養板中，混勻后放入37℃、5%CO2培養箱24 h,3 d更換一次新鮮培養液，當細胞融合度在70%～80%時，進行繼代培養。

1.2.4BMSCs的細胞周期檢測 實驗分組同凋亡檢測，消化收集細胞后，加入細胞周期液，放置30 min，然后使用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.5細胞增殖情況檢測 采用MTT比色法檢測各組骨BMSC增殖情況，在細胞培養后將細胞濃度調整至3×104個/ml，接種于96孔板中，把200 μl細胞懸液加入每個孔中，在37℃、5%CO2溫度下培養24 h、48 h、72 h后，加入10 μl MTT試劑繼續孵育4 h，采用酶標儀測定波長為570 mm的細胞組OD值，計算各組細胞增殖率。細胞增殖率=(細胞組OD值/參照組OD值)×100%。

1.2.6細胞凋亡情況檢測 使用流式細胞儀檢測各組BMSC凋亡情況，將細胞傳到5孔板中，在37℃、5%CO2溫度下培養24 h、48 h、72 h后，加入0.25%胰蛋白酶消化，2 000 r/min離心處理5 min，收集離心處理后的細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復清洗2次，每次清洗3 min，再次離心收集細胞，加入1 ml PI染液，在避光常溫下放置1 h，使用流式細胞儀檢測，用特異熒光標記，標記后在鞘液包裹下快速流動，流動期間發射光子，利用發光信號測量儀檢測光子數值。

1.2.7細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗檢測各組BMSC遷移能力，將細胞接種于18孔板中，細胞增長至90%左右時，采用100 μl槍頭垂直劃3條直線，使用PBS反復清洗3次，每次清洗3 min，加入0.5%血清培養基并觀察24 h，使用倒置顯微鏡觀察各組BMSC遷移能力。

1.2.8細胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室檢測各組BMSC侵襲能力，將Transwell小室放入培養板中，細胞懸液接種于上室，100 ng/ml IL-8接種于下室，24 h后100 μg/ml三羥甲基丙烷(TMP)溶液加入下室并孵育24 h，將上室微孔中的細胞使用棉簽擦除，PBS反復清洗3次，每次清洗3 min，固定在4%多聚甲醛溶液中處理15 min，使用蘇木精染色處理10 min，用PBS清洗，每次清洗3 min，在倒置顯微鏡下觀察上室微孔下層的細胞數，觀察各組BMSC侵襲能力。

1.2.93組細胞PI3K/Akt蛋白信號通路表達量檢測 采用Western印跡檢測各組細胞PI3K/Akt蛋白信號通路PI3K、Akt蛋白表達量，取RIPA裂解液150 μl及苯甲基磺酰氟(PMSF)1.5 μl加在冰上孵育30 min，4℃ 1 500 r/min離心15 min，取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。每樣樣品取15 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉移至聚偏氟乙烯(PDVF)膜，5%脫脂乳室溫封閉2 h,將PI3K、Akt一抗加入4℃孵育過夜；在1∶5 000二抗TBST(北京中杉金橋生物技術公司)中加入TBST，用增強型敏化學發光底物試劑(ECL)處理，然后在凝膠成像系統顯像，采用Image J軟件進行蛋白定量分析。每組檢測3次取平均值。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行F檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1GDF-5表達量比較 與對照組(2.02±0.59)相比，下調組GDF-5表達量(0.51±0.12)明顯降低(P<0.05)；與對照組相比，上調組GDF-5表達量(3.72±1.17)明顯升高(P<0.05)；與下調組相比，上調組GDF-5表達量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2BMSCs的細胞周期分布 與對照組相比，下調組G1期明顯上升，S期、G2期明顯下降，上調組G1期明顯降低，S期、G2期明顯升高(均P<0.05)；與下調組相比，上調組G1期明顯降低，S期、G2期明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 BMSCs的細胞周期分布

2.33組細胞不同時間點增殖率、凋亡率比較 與對照組相比，下調組不同時間點增殖率明顯降低，凋亡率明顯升高，上調組不同時間點增殖率明顯上升，凋亡率明顯降低，差異有統計學意義(均P<0.05)；與下調組相比，上調組不同時間點增殖率明顯上升，凋亡率明顯降低，差異有統計學意義(均P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 3組不同時間點細胞凋亡流式檢測細胞凋亡

表2 3組細胞不同時間點增殖率、凋亡率、細胞遷移、侵襲能力比較

2.43組細胞遷移、侵襲能力比較 與對照組相比，下調組細胞遷移明顯降低，侵襲數明顯升高，上調組細胞遷移明顯上升，侵襲數顯著下降(均P<0.05)；與下調組相比，上調組細胞遷移明顯上升，侵襲數明顯下降(均P<0.05)。見表2、圖2、圖3。

圖2 GDF-5轉染后BMSC遷移比較(×200)

圖3 GDF-5轉染后BMSC侵襲比較(蘇木精染色，×200)

2.53組細胞PI3K/Akt信號通路蛋白表達量比較 與對照組相比，下調組PI3K、AKT蛋白表達量明顯升高，上調組PI3K、Akt信號通路蛋白表達量明顯降低(均P<0.05)；與下調組相比，上調組PI3K、Akt信號通路蛋白表達量明顯降低(均P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 Western印跡檢測各組細胞PI3K/AKT信號通路蛋白表達

表3 3組PI3K/Akt信號通路蛋白表達量比較

3 討 論

BMSCs來源較廣、容易獲取、無醫學倫理學爭議等優點，是目前骨組織工程最理想的種子細胞來源。BMSC有血管生成、抗凋亡、抗纖維化、抗炎和免疫抑制等生物學特性〔6，7〕。骨髓包含多種細胞，包括血管細胞、脂肪細胞、成骨細胞、破骨細胞、造血干細胞、間充質干細胞等〔8，9〕。早期認為骨髓中細胞的功能只是骨髓細胞再生、循環血細胞再生，骨髓干細胞將有可能成為治療遺傳病或變性疾病的理想來源細胞〔10，11〕。本研究結果顯示，GDF-5可有效促進大鼠BMSC增殖、遷移。

GDF5是BMPs家族的成員，是機體軟骨形成、骨骼發育的主要調節因子，在軟骨形成的早期，GDF5可促進間充質軟骨前細胞的黏附、聚集、分化〔12，13〕。外源性GDF5可促進BMSC的增殖及BMSC的成軟骨分化，在促進軟骨細胞特異性細胞外基質分泌、合成，軟骨細胞基因及蛋白表達方面有明顯效果，提示將GDF5用于促進脂肪間充質干細胞成軟骨分化進而用于細胞治療方面可發揮更重要的作用〔14，15〕。金林等〔16〕研究顯示，GDF-5可以誘導BMSC呈肌腱細胞分化，且去分化過程可以提高BMSC腱系分化的能力，且BMSCs在去分化后具有更高的增殖和分化潛能，經過GDF-5處理的去分化的BMSCs更具有成肌腱細胞分化的優勢。本文研究顯示，GDF-5可以作用于PI3K/Akt信號通路，促進PI3K、Akt蛋白表達，有效促進BMSC向類髓核細胞分化，PI3K/Akt信號通路存在于細胞中，參與生物學過程的調控，在腫瘤的發生、發展、轉歸中起到關鍵的作用。PI3K是位于胞質的脂類激酶〔17〕。經成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)-l、表皮生長因子(EGF)等生長因子激活后，可以使質膜上的二磷酸磷脂酰肌磷酸化為三磷酸磷脂酰肌醇。Akt包含480個氨基酸殘基，屬于一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。作為第二信使，磷脂酰肌醇3磷酸(PIP)3可以將Akt募集到質膜，因此，Akt會被激酶丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)1、自噬和雷帕霉素靶蛋白復合物Ⅰ(mTORC)2分別磷酸化，然而信號傳遞到叉頭基因(FoxO)、糖原合酶激酶(GSK)-3、mTORC1等效應蛋白〔18，19〕。黎鑫等〔20〕研究顯示，在異常微環境中培養高表達IGF-1的BMSCs可以減少細胞凋亡，增加增殖，增加原癌基因表達。PI3K抑制劑、Akt磷酸化抑制劑可以逆轉BMSCs因IGF-1引發的增殖、凋亡相關生物學特性的改變，提示PI3K/Akt信號通路是IGF-1誘發BMSCs轉化過程中的重要信號轉導通路。人類多種惡性腫瘤中IGF-1在異常表達,且與疾病的發生、發展緊密相連。有研究發現，IGF-1等生長因子可以激活PI3K/Akt信號，下游效應蛋白mTORC1/S6K1可促進成骨細胞分化，抑制其凋亡，體外破骨細胞上清也可通過該信號調節成骨細胞的增殖分化〔21〕。PI3K/Akt信號通路可抑制成骨細胞分化。本研究顯示，上調GDF-5可促進BMSC凋亡，抑制增殖、遷移、侵襲，并進一步明確其作用機制，結果發現上調GDF-5經作用于PI3K/Akt信號通路，可促進PI3K、Akt表達，發揮其促進BMSC凋亡，抑制增殖、遷移、侵襲的作用。